干货分享丨血浆/血清/红细胞中叶酸检测
在科研工作中，你是不是也曾被这个问题困扰？
在调研文献的时候，明明都是测叶酸，有的文献是测血浆，有的是血清，甚至还有测红细胞的？到底哪种样品类型最合适？
好不容易确定了这个问题，检测方又抛出了一个新问题，是要测普通叶酸？还是测活性叶酸？大脑CPU都要被烧干了，这两者又有什么区别？
接下来，我们用最具学术精神的回答，溯源每个问题的本真。
各种类型血样的定义？制备？
欢迎参考我们前面发表的一篇文章《干货分享丨全血/血浆/血清/红细胞中脂肪酸检测》，但是叶酸跟脂肪酸不同的是，临床和科研中，关于不同样本类型中叶酸的检测，范围和定义差别居然很大。
如何制备这些血样？
红细胞叶酸（临床）：采空腹静脉血，全血需经溶血后制成溶血样本，用于红细胞叶酸的测定（WS/T 600-2018）。注意，这样处理后测到的红细胞中叶酸，严格意义上来说是红细胞和血浆中叶酸之和。那检测哪些指标呢？居然包括非代谢性型叶酸（UMFA）、四氢叶酸（THF）、5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH2-THF）、5-甲醛四氢叶酸等多种叶酸形式之和，也称为总叶酸。临床实验室主要使用蛋白结合法检测，在此之前则使用微生物分析法进行检测，这两种方法都无法区分单种叶酸（DOI：0.3969/j.issn.1673-8640.2016.03.019）。叶酸缺乏的阈值为红细胞总叶酸<340 nmol/L（151 ng/ml）。
血清叶酸（临床）：采集血清后，使用蛋白结合法检测总叶酸，叶酸缺乏的阈值为血清总叶酸<10 nmol/L（4 ng/ml）。注意，溶血样本不能用于血清叶酸的测定，溶血样本中因红细胞中叶酸溶出致血清叶酸显著升高。
血浆叶酸（临床）：采集血浆后，使用蛋白结合法检测总叶酸。注意，溶血样本不能用于血浆叶酸的测定，溶血样本中因红细胞中叶酸溶出致血浆叶酸显著升高。
叶酸（科研）：一般采用液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）检测叶酸。更为灵敏和特异，可以定量检测各个单种叶酸的浓度。但是叶酸化学性质不稳定，也对检测构成一定挑战。检测的样品类型可以覆盖全血、红细胞、血清、血浆等，但是科研检测时指的红细胞，往往就只单指红细胞，除了需要使用新鲜的全血样本分离红细胞，还需要记录全血的体积，并检测红细胞压积来用于红细胞中叶酸的定量计算，单位往往是ng/mL或nmol/L。有的科学研究中也直接使用红细胞体积用于定量计算。
质谱法与微生物法或蛋白结合法进行比较时，需要定义质谱法总叶酸的组成。根据目前实验室检测能力，质谱法总叶酸一般包括FA、5MeTHF和5FoTHF（DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。
血样的保存条件和时间？
红细胞叶酸（临床）：制成溶血样本前的全血，保存条件是20℃~25℃下2h，2℃~8℃下24h，-20℃下可稳定1个月（仅适用于含K3EDTA抗凝剂的血样），用于测定红细胞用的溶血样本，-20℃稳定1个月，限一次冻融（WS/T 600-2018）。
血清叶酸（临床）：在15℃~25℃可稳定2h，2℃~8℃可稳定48h，-25℃~-15℃可稳定28d，只可冻融1次。避光保存。若标本不能及时检测，建议于-70℃条件下存放标本，限一次冻融。
血浆叶酸（临床）：在15℃~25℃可稳定2h，2℃~8℃可稳定48h，-25℃~-15℃可稳定28d，只可冻融1次。避光保存。如果不能立即测量，将样品于2℃~8℃储存。
科研检测样本，要求在样品收集过程中要尽可能减少较高温度（如室温）暴露时间、避免开放式放置，保存在-80℃条件下，避免冻融。
叶酸的结构和存在形式？
叶酸是食物中自然存在的一类水溶性B族维生素的总称，自然存在的叶酸大多数是蝶酰多谷氨酸。蝶酰谷氨酸（folic acid，FA）是叶酸的完全氧化形式，也是最常用的叶酸补充剂，由喋啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸组成。FA为人工合成品，本身不具有辅酶活性。FA被人体摄入后，在二氢叶酸还原酶的两次还原作用下，先后还原为二氢叶酸（dihydrofolate，DHF）和四氢叶酸（tetrahydrofolate，THF），后者为一碳单位代谢的辅酶。THF的N5位和N10位被不同氧化水平的一碳单位取代基占据，形成的主要代谢物包括5-甲酰基四氢叶酸（5-formytetrahydrofolate，5FoTHF）、10-甲酰基四氢叶酸、5，10-亚甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸（5-methyltetrahydrofolate，5MeTHF）。其中，5MeTHF在人体内含量最高，占比约是82%~93%（DOI：10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。超过95％的叶酸存在于红细胞中（Gunter, 1996）。
血清或血浆叶酸水平反映短期个体叶酸储量，受近期摄入影响，红细胞叶酸更能真实反映出组织内叶酸水平，检测前需要进行血细胞溶血，方法间差异大（DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200519-00481）。叶酸结果只能同类型样本相比较，也只能同种检测方法相比较。
测哪种叶酸？
如果是用临床上微生物法或蛋白结合法进行检测，目标物不可更改，只能是总叶酸。如果是用质谱法进行科研探索，在目标明确的情况下，可以仅检测感兴趣的单体叶酸，进行靶向定量检测。
至于活性叶酸、非活性叶酸等名称，主要围绕妊娠期的营养补充剂类型展开，将主要成分是5-MTHF定义为活性叶酸，将主要成分是蝶酰谷氨酸（叶酸，VB9）的定义为普通叶酸，并倡导孕妇进行补充。至于打出天然叶酸招牌的，基本上不太用理会。
总而言之，用什么样品类型？测哪些叶酸？用什么方法测？取决于研究的具体目的和需求，并没有完全绝对的结论。
参考文献：
1.WS/T 600-2018人群叶酸缺乏筛查方法
2.血清叶酸和红细胞叶酸检测的临床应用，陈朴、潘柏申，检测医学，2016年3月第31卷第3期。
3.叶酸检测标准化现状及挑战，易喜连、张江涛、张传宝，中华检验医学杂志，2020年12月第43卷第12期。
4.Results of an international round robin for serum and whole-blood folate. Gunter EW, Bowman BA, Caudill SP, et al. Clin Chem 1996; 42(10): 1689-1694.
