新文速递丨Biophys Rep 50种脂肪酸的快速定量方法
脂肪酸（FAs）是所有具有多种生理功能的生物体的重要营养素，定量分析大量人群队列中少量生物样品的脂肪酸组成（脂肪酸组）对于理解这些功能至关重要。脂肪酸通常可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸（包括n3和n6）是哺乳动物以及人类的必需脂肪酸，在生物样品中，这些脂肪酸以游离脂肪酸（FFAs）和酯化脂肪酸的形式存在，例如磷脂、鞘脂（SPs）、甘油酯、胆固醇酯（CEs）、羟基脂肪酸的脂肪酸酯（FAHFAs）和酰基肉碱。FAs及其代谢物的生物学功能多种多样，包括细胞膜稳态、能量生成、转录因子活性的调节和信号传导。各种形式的FAs被进一步认为是营养状况、心脏代谢和神经退行性疾病以及癌症的指标。例如，一组由八种脂肪酸组成的生物标志物可以有效地指示细胞活力，并表征胺碘酮的肝毒性。FAs的生物学功能不断出现，但远未完全了解，因此在少量样品中定量脂肪酸组成的高通量方法仍然是必不可少的，特别是对于大型队列研究。
FAs的定量通常使用GC-FID/MS，具有高灵敏度、分离位置异构体和顺反异构体的能力、出色的稳定性以及脂肪酸甲酯（FAMEs）数据库的可用性。通过测量由碱或酸催化的酯交换反应产生的脂肪酸甲酯来实现。前者包括氢氧化钾（KOH-MeOH）和甲醇钠（NaOCH3），后者包括三氟化硼（BF3-MeOH）、甲醇盐酸（HCl-MeOH）、甲醇硫酸（H2SO4-MeOH）和甲醇乙酰氯（CH3COCl-MeOH）。然而，碱基对FFAs和SMs的甲基化无效，而BF3-MeOH不稳定且有毒，HCl-MeOH和H2SO4-MeOH制备不方便，高温下可形成副产物，CH3COCl-MeOH是最合适的方法。
复旦大学人类表型组研究院分子表型代谢组平台唐惠儒教授团队开发了一种使用CH3COCl-MeOH的酯交换方法并确保所有重要形式的脂质中的FAs完全甲基化，然后开发了一种快速GC-FID/MS方法，通过8分钟的数据采集同时定量多种生物基质中的所有FAs。进一步建立了FAMEs的无加性保留指数（NARI）来纠正批次效应，并建立了分析物的定量结构-保留关系（QSRR）模型来预测没有标准的FAMEs的保留率。原文链接：https://doi.org/10.52601/bpr.2023.230042。我公司参与了该研究中脂肪酸检测方法的部分开发工作。
研究内容
采用Agilent 9000气相色谱（GC）系统，火焰电离检测器（FID）和Agilent 5977B电子电离质谱仪（Agilent Technologies, USA）进行定量。采用人血浆样品，系统优化了CH3COCl浓度、反应时间和温度等参数。对方法的灵敏度、线性、精密度、准确度和稳定性进行验证。利用45个FA标准的FAMES的实验tR值，针对其碳链长度（CL）、双键数（DB）和DB位置（DBP）等结构特征，构建多变量正交多项式回归模型（MOMR）。采用r -软件的LM函数进行评价，并进行5次交叉验证，得到预测误差最小的模型。在无任何外源性添加剂的情况下，选用内源FAs中FAMES的实验tR值建立保留指数，以校正不同实验条件（如温度梯度、流速和批间变化）导致的tR变化。
研究结果
1.脂肪酸的高效酯交换及GC-FID/MS定量分析
将所有脂质中的FAs有效转化为FAMEs是使用GC-FID/MS对其进行高覆盖率定量的先决条件。MeOH-CH3COCl是一种温和、安全的酯交换试剂。优化到最佳反应参数：乙酰氯浓度为CH3COCl 12.5%, 衍生化反应条件为73°C, 时长3 h和甲醇/己烷比（V/V）为6:1，可使95%的脂质甲基化（图1A），不同碳链长度的单键和双键不饱和脂肪酸的异构化副产物均小于2%（图1B）。
图1 A不同脂类的转甲基化效率（12.5% CH3COCl, 73℃，3 h）。包括胆固醇酯（CE）、甘油三酯（TG）、二甘油三酯（DG）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、游离脂肪酸（FFA）、羟基脂肪酸脂肪酸酯（FAHFA）、酰基肉碱（ACar）、鞘磷脂（SM）和神经酰胺（Cer）。B一些代表性不饱和脂肪酸的异构化与温度和CH3COCl浓度的关系。C 10 μL人体体液（尿液和血浆）和10 mg其他生物基质（H1299细胞、小鼠盲肠内容物和兔肝组织）中脂肪酸的浓度。
全面优化的GC-FID/MS参数在8分钟内完成了FAs的同时定量，显示了异构体的良好分离，如C18:3n6-C18:3n3和C18:2n6t-C18:2n6c（图2）。此外，该方法具有良好的线性（R2＞0.994），柱上的检出限（信噪比~3）和LOQ（信噪比~10）分别低于20和40 fmol（低至0.5和2 fmol）。对于三种浓度水平，日内和日间CV值均低于20%（95%的分析物低于15%），回收率为80%-120%，在自动进样器（20°C）中以及储存温度为4°C和-80°C条件下稳定性良好（CV＜15%）。
图2 45个甲基化FAs的GC-FID/MS分析的总离子色谱图
2.适用多种典型生物基质中脂肪酸定量分析
这种方法适用于多种典型生物基质（包括人类尿液、血浆、细胞、动物肠道内容物和肝组织样品）中脂肪酸的定量分析。结果显示这些生物样品的FA组成和分子表型存在显著差异（图1C），人血浆中FAs的组成与报道大致一致，成功地定量了健康人血浆中的30种FAs，包括一些低水平的FAs。
3.FAMEs的定量结构-保留关系和无添加剂保留指数
分析物的定量结构-保留关系（QSRR）对于预测其保留时间至关重要。实验tR结果清楚地显示了FAMEs的碳链长度（CL）、双键数（DB）和位置（DBP）的依赖性。利用MOMR和最佳子集选择方法，利用45个代表性FAMEs的数据建立了tR作为CL(c)， DB(d)和DBP(p)函数的经验数学模型，tR=- 6.11E−4c3+2.56E−3c2p+4.58E−2c2+8.21E−3cd2-0.18d2-0.10cp- 0.78c+0.22d+0.97p+5.85。五重交叉验证表明，模型信度相关性好（R2, 0.9871），残差标准误差较小（0.16 min）。这45个FAMEs的模型计算值（tRC）与实验保留时间（tRE）具有良好的相关性（R2 ~0.9899） （图3A）。对于未纳入模型构建但在生物样品中检测到的5种测试分析物，其预测tR值与实测值一致，ΔtR< 0.38 min（图3B）。
图3 （A）定量结构-保留关系得出的实验值（tRE）和（B）计算值（tRC）的相关性和六种测试分析物的预测精度
此外，为了纠正由于不同温度梯度、流速和采集批次而导致的tR漂移，开发一种无添加剂保留指数（NARI），使用样品中内源性的饱和脂肪酸甲酯（SFAMEs）代替传统的RI中添加的烷烃。在本研究中，在同一批分析的多种不同基质（混合FAME标准品、人尿、血浆、H1299C细胞、小鼠粪便和兔肝组织）中，所有分析物的保留时间都有微小的变化（ΔtR < 0.04 min）。相比之下，不同温度梯度、流速和批次之间的保留时间差异要大得多，从三组SFAMEs得到三种不同的NARI方案都显示出对不同温度梯度、流量和批次的tR变化的修正能力。
研究结论
开发的一种8分钟的GC-FID/MS方法，可同时定量生物样品中的FA成分，具有飞摩尔级的灵敏度、良好的准确度、精密度、稳定性以及对生物流体、细胞、肠内容物和组织的适用性。对这些生物样品的分子表型进行了定量表征，显示哺乳动物细胞、肝脏和血浆样品中多种奇碳脂肪酸的水平异常高，与饮食和肠道微生物有关。建立了内源性分析物的无添加剂保留指数，以便比较不同批次的tR数据，进一步建立了具有可变链长、双键数和位置的FAMEs的定量结构-保留关系，可预测没有标准品情况下FAMEs的tR值。
不同种类样品中测到的FA数量
