合作文章丨J Pharm Anal酰基肉碱定量方法开发
酰基肉碱主要来源于线粒体、过氧化物酶体和内质网中的脂肪酸和支链氨基酸。根据酰基链长度可分为短链(C2-5)、中链(C6-12)、长链(C13-20)和超长链(> C20)酰基肉碱，其中部分酰基肉碱的酰基链上含有羟基、羧基或侧链甲基，或与许多亲水性化合物（包括氨基酸、葡萄糖醛酸和磺酸）共轭。这些酰基肉碱不仅在脂质和氨基酸的代谢稳态、脂肪酸运输和宿主-微生物共生等方面发挥着重要作用，而且部分酰基肉碱作为2型糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病、非酒精性脂肪性肝病、肿瘤和先天性代谢缺陷的生物标志物。然而，各种酰基肉碱的结构和物理化学性质存在巨大差异，目前仍然缺乏高通量高覆盖的酰基肉碱定量方法用于支链、羟基化、羧化和共轭酰基肉碱的功能研究。
超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-MS）在同时定性定量酰基肉碱方面具有巨大的潜力。超高效液相色谱-高分辨率质谱法（UPLC-HRMS）受限于扫描速度和动态范围，故对于含有多不饱和、羟基化和羧化酰基链的低丰度酰基肉碱具有较低的定性定量准确性。相对地，多反应监测模式（MRM）目前作为超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）定量分析的最佳选择，存在热不稳定性、覆盖度低、通量低或异构体区分有限等问题。因此，所有报道的UPLC-MS/MS方法只覆盖了少数羟基化和羧化的酰基肉碱，而没有共轭的酰基肉碱。此外，基于UPLC-MS/MS的高覆盖酰基肉碱定量方法的主要瓶颈之一是缺乏可靠的标准品来获得所有可能的酰基肉碱的保留时间（tR）。然而，定量结构-保留关系（QSRR）建模虽然有助于预测酰基肉碱tR，但这类研究只考虑了酰基链上的碳原子和双键数量。
复旦大学人类表型组研究院分子表型代谢组平台唐惠儒教授团队首先开发了一种基于UPLC-MS/MS结合MRM采集模式的定量方法，可用于在10分钟内同时定量生物体液和组织中所有可识别的酰基肉碱。然后，利用酰基肉碱7个结构特征，构建了其tR值的QSRR模型用于预测更多酰基肉碱的tR值，从而进一步建立了文献中检测到的1136种酰基肉碱的MRM参数（tR、MRM离子对与碰撞能量值）数据库。最后，该团队进一步定量了两种典型人体生物体液（血浆和尿液）和五种典型动物模型组织中的酰基肉碱，以揭示其分子表型特征。
研究方法
首先，采用异丙醇/水溶液提取不同生物基质中酰基肉碱。再者，采用UPLC-QTOFMS定性分析酰基肉碱标准品的tR与特征碎片，并鉴定出不同生物基质中酰基肉碱种类。然后，基于R语言中LM函数来构建酰基肉碱tR值的QSRR预测模型、并建立文献中检测到的1136种酰基肉碱的MRM参数（tR、MRM离子对、碰撞能量）数据库。最后，经方法学考察，对多种生物基质中酰基肉碱进行定量分析与分子表型描述。
研究内容
1. 基于UPLC-QTOFMS多种基质酰基肉碱分析
相比负离子模式，在正离子模式下所有酰基肉碱均产生更强烈的信号，包括母离子[M]+（源于左旋肉碱季铵阳离子）、[M-59.0735]+（N(CH3)3的中性损失）和来自左旋肉碱部分的三个特征碎片（m/z 144.1019、85.0284和60.0808）。同时，所有共轭酰基肉碱均产生母离子[M]+、[M-共轭物-59.0735]+和来自肉碱部分的三个特征碎片。由于特征碎片m/z 85.0284响应值均最强，故 [M]+/85.0284可作为酰基肉碱的MRM定量离子对。[M-共轭物-59.0735]+是共轭酰基肉碱唯一的高响应特征碎片，故[M]+/[M-共轭物-59.0735]+可用于作为定量MRM离子对。基于上述MRM定性定量分析方法，多种生物基质（兔肝组织、人源血浆、尿液和细胞）及其混合样品中鉴定出471种酰基肉碱，其中包括395种酰基肉碱和76种共轭酰基肉碱。
图1 （A）酰基肉碱（C10:0）与（B） N -乙酰半胱氨酸共轭-羟基酰基肉碱（N-acetylcys-C10:1-OH-CA）在正离子模式下的碎裂模式。
2. 酰基肉碱定量结构-保留关系(QSRR)和MRM参数数据库
利用R语言中LM函数构建了该色谱条件下酰基肉碱的QSRR模型（式3），45种酰基肉碱标准品的计算保留时间（tRC）与实验结果（tRE）具有良好的线性相关性（r2> 0.998）和准确性（△tR< 0.20 min，MAE < 0.07 min）。该模型对于混合样品中检测到的所有211个酰基肉碱均具有良好的tRC与tRE相关性（r2 ~ 0.984）和预测精度（MAE< 0.21 min和△tR < 0.9 min），其中包括不同酰基碳链、支链甲基、碳碳双键、羟基或羧基数目的酰基肉碱。即使在这些结构特征同时存在的情况下，从混合样品中鉴定出97%酰基肉碱的tRC与tRE相关性和准确性均优。基于此，一个MRM参数（tR、MRM离子对和碰撞能量）数据库被进一步建立，其中涵盖了含398个化学结构式的1136种酰基肉碱（包括酰基肉碱、共轭肉碱及其异构体）。
tRC = k0 + k1c3 + k2c2 + k3c + k4b+ k5d + k6h + k7j+ k8p + k9q+ k10ch (式 3)
（其中，k0 = –0.252, k1 = 8.54×10–4, k2 = –4.82×10–2, k3 = 1.06, k4 = –0.487, k5 = –0.172, k6 = –1.65, k7 = –1.55, k8 = 0.152, k9 = –1.59×10–2与k10 = 7.20×10–2。模型中变量c、b、d、h、j分别表示酰基链碳、支链甲基、碳碳双键、羟基、羧基的个个数，p、q表示支链和双键的位置。）
图2（A）45个酰基肉碱标准品与（B）生物样品中检测到的酰基肉碱模型计算保留时间（tRC）与实验结果（tRE）的比较。
3. 多种生物基质中酰基肉碱的定量分析以表征其分子表型
在2种典型的人源生物液体（血浆和尿液）和5种小鼠组织（肾脏、肝脏、心脏、肺和肌肉）中共定量出514种酰基肉碱，用于表征其酰基肉碱分子表型。其中，人源尿液样本中含有421种酰基肉碱多于人源血浆（149种）和小鼠组织（包括肾211种、肝195种、心脏189种、肺188种与肌肉169种），特别是共轭酰基肉碱与含有羟基和羧基的酰基肉碱。
图3 多种生物基质中不同类型的饱和（sAC）、不饱和（uAC）、羟基化（AC-OH）、羧化（AC-DC）与共轭酰基肉碱（CAC）的浓度（c）。其中粗线（sum）与细线表示每类总浓度与每种浓度分布。
全文总结
建立的高通量UPLC-MS方法可实现多种生物基质中数百种酰基肉碱和共轭酰基肉碱的定量分析。同时，构建的定量结构-保留关系模型，可用于无标准品条件下酰基肉碱的tR值预测。最后，该定量方法通过量化2种人源生物体液与5种小鼠组织中500多种酰基肉碱，不仅为这些生物基质的分子表型提供了数据，也为大型队列疾病研究提供了一种重要且可靠的分析技术。多种生物基质的高通量高覆盖酰基肉碱定量方法于2023年10月发表在医学领域期刊J Pharm Anal上(online)。
