干货分享丨代谢流分析介绍

01 什么是代谢流分析？

代谢流分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）是利用稳定同位素示踪技术，检测下游代谢产物的同位素取代形式（M+0/ M+1/ M+2/ …），从而分析出该化合物在代谢通路中的流向和分布。通过对生物体进行代谢流分析，可得到生物体特定代谢通路的活跃程度。

02 为什么要做代谢流分析？

通常代谢组学检测的是生物样本中的代谢物浓度，而代谢流反映的是细胞内代谢反应的速率。这其中就包括在酶参与下的中间产物的转化、代谢物在各器官、组织间的转运速度等。用交通车流来举个例子：马路上的车流量（通量）随着车辆数量（浓度）的增加而增加，当发生交通拥堵时，车辆数量（浓度）是高峰，而车流量（通量）确近乎零。同样，在代谢过程中，代谢物的积累（高浓度）可能是由于合成的增加，也可能是由于代谢的减少。要想知道这个代谢物的主要活性途径、各个途径的相对贡献和分布变化特点，就需要用到代谢流分析。

因此，代谢流能揭示代谢调节的位点和机理，并且加深我们对代谢物如何参与细胞决策的理解。此外，在病变细胞中，代谢流信息也能帮助我们进行治疗手段的选择。

03 哪些情况需要做代谢流分析？

需要回答“从哪来？”和“到哪去？”的研究，都需要做代谢流分析。举例 ：肿瘤细胞的碳源来源、特定靶点诱导或抑制后代谢通路的活跃或抑制程度。

与代谢流相关的几个常见的关注问题是：1）发现特定营养物的分解代谢命运；2）发现一个给定的细胞内化合物的生物合成起源；3）对特定代谢节点或反应的通量进行有针对性的分析；4）测定细胞氧化还原平衡（例如：NADPH和NADH）和能量（ATP）载体。

04 代谢流分析如何做实验设计？

代谢流一般有两种基本的实验设计方式，包括静态实验和非静态实验。

静态实验：在同位素标记平衡终点进行测量。优点：同位素标记模式完全取决于代谢物水平。缺点：只能解决不同通路对同一衍生物的相对贡献率，不能根据时间进行线性定量，需要持续足够的时间以达到同位素稳态。

非静态实验：在达到同位素标记平衡之前进行测量。优点：标记实验可以短至几分钟，可以根据时间进行线性定量。缺点：需要对多个时间点的同位素标记情况进行测量，样本的检测和分析过程更为复杂，并且，同位素标记水平取决于代谢流量和细胞内代谢物水平。

因此，我们首先要明确所关注代谢通路和相关代谢物，然后往培养基中添加13C标记的“来源物质”，根据相关代谢通路确定合适的培养时间，收获样本（细胞、培养基）后液氮速冻，转移至-80度冰箱保存，送检时使用干冰快递寄出。

05 细胞培养时间是多长？

没有一个固定值，对于静态实验来说，细胞培养时间（标记的持续时间）取决于感兴趣的途径多长时间达到一个代谢稳态。通常在糖酵解途径中是10分钟，TCA循环约2小时，核苷酸则需要不少于24小时。

06 代谢流检测用什么技术？

主要是用质谱技术，对于丰度较高的代谢物如葡萄糖也可以用NMR技术。质谱主要是利用不同取代形式的质量数有差别进行区分。

07 博莱克可以检测哪些代谢流？

从理论上说，靶向定量检测项目中包括的代谢物，我们都可以检测代谢流。比如TCA、胆汁酸、氨基酸等。但是并不是所有目标物都有合适的方法进行检测，具体情况需要咨询我们。

08 代谢流结果会以什么形式交付？

大部分时候，我们交付的是相对定量结果，即该种同位素形式占总和的百分比。该目标物各种同位素形式的峰面积之和为1。

如果客户有特殊要求，我们会根据检测项目评估是否可以做绝对定量，交付浓度结果。但是对于丰度较低的同位素形式，可能存在定量结果不准确（低于定量限）甚至检测不到的情况。

09 送检需要的样本类型和样本量是多少？还需要哪些信息？

细胞和培养基上清均可以检测代谢流，样品量根据关注的代谢通路有所区别，详情可以咨询我们。

除了样品类型、细胞个数以外，还需要告诉我们细胞培养时的使用的同位素（取代信息）和关注的目标物。

10 结果中M+2是什么意思？

我们用M来代表未被取代的目标物，M+1代表分子量比目标物+1（如果是13C标记物培养的，就代表有1个12C被13C取代了的形式），M+2以此类推。

以丙酮酸为例，实验用13C全标的谷氨酰胺培养，就会存在M/M+1/M+2/M+3共4种同位素取代形式，因为丙酮酸本身只有3个碳原子。M+2又会有3种同分异构体形式，质谱无法区分这些同分异构体，给出的是这3种同分异构体之和。