基于LC-MS的靶向代谢组分析被广泛用于小分子代谢物的检测。然而，目前业界还没有被广泛接受的标准来确保目标代谢物检测方法的可靠性。近日，来自英国代谢表型协会的研究人员于2023年5月在Nature protocols杂志上发表观点性文章，总结了欧洲药品管理局、美国食品和药品管理局和国际技术协会协调理事会提供的相关指导。在此基础上进行综合和调整，提出一个相对简单的，可用于评估代谢组分析可靠性的“分级方法”，包括发现、筛选、鉴定和验证四个方面。考虑了代谢组分析中所遇到的各种问题以及可能的解决方法。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-022-00801-8。

代谢组学是研究代谢组的一门科学，而广义的代谢组包括宿主内源性代谢物、外源性小分子物质以及微生物来源的代谢物。代谢组学在系统生物学研究中起了重要作用，其揭示了从基因到代谢活动的变化，以及基因与环境之间相关作用的代谢网络。此外，代谢组学还可以用于生物标志物的发现。

代谢组学分析方法通常可以分为靶向分析、非靶向分析以及二者相结合。非靶向代谢组学是一种以发现为基础的方法，其目的是尽可能多的无偏倚地检测代谢物，然后再将与表型相关的代谢物（或者叫生物标志物）进行鉴定。靶向代谢组分析则侧重于分析已知代谢物，其所用方法通常是定量一类代谢物。靶向代谢组学是以假设为基础，由于测量已知代谢物，通常具有较高的灵敏度和选择性，不足之处是代谢物覆盖范围有限。非靶向代谢组学主要用于产生假设，具有较大的代谢物覆盖范围和生物标志物发现潜力，其不足之处是所检测代谢物为相对定量，而不是绝对浓度。

用于代谢组分析的主要技术包括LC-MS、GC-MS和NMR，其中LC-MS使用最为广泛。靶向方法的难点之一在于获得合适的内标。另一方面，靶向检测的优点是目标代谢物是已知的，因此对其预期水平、转化速率以及个体内和个体间的差异比较了解，有利于分析人员开发合适的检测方法来产生可靠的数据。然而，由于对新发现的生物标志物知之甚少，方法开发要重点关注并行性、选择性和灵敏度，在稍后检测阶段可以对方法进行微调以满足检测要求。

代谢组学已经被用于发现新的临床和毒理诊断标志物。然而，代谢组学研究进行临床转化还存在一些挑战，存在的主要问题包括分析的可重复性、准确性、精密度、代谢物的定性和定量、研究设计、样品处理，缺少发表数据的标准化报告，数据的开放获取不够，在Biobank中的整合不足，不同批次之间存在变异，不同方法存在偏倚。鉴于上述代谢组学分析的特点，要评估代谢组学分析方法的可靠性并不容易。因此有必要定义评估方法可靠度的程度，评估的范围，以及如何选择合适的标准和报告方法。

在本文中，作者提出了评估基于质谱的靶向代谢组分析可靠性的指南。现有的生物分析方法验证指南，包括四级框架，生物分析检查清单如Box1所述。

建议的用于评估代谢组学分析方法可靠性的分级框架指南

考虑到代谢组学应用广泛，LC-MS技术不断发展，很显然有必要提出一个描述可靠性的统一框架，能胜任于不同的应用。对是否符合目的的评估涉及到以下问题：（i）该分析的使用背景，即数据是用来做什么的；（ii）是定量、半定量还是相对定量分析；（iii）评估对不确定性的容忍度。建议的框架指南总结在Table 1，第1和第2级（Tiers 1 and 2）针对靶向代谢组学为本文的重点，所有用于评估的参数总结在Table 2。

第1级：经过验证的方法

第1级验证涉及通过使用传统的靶向代谢物分析进行疾病和毒性表型的诊断，通常可以对一到十几种代谢物进行绝对定量。第1级验证是符合法规的临床诊断机构所必需的，这一过程需要每种代谢物都有相应的标准物（外标）。

第2级：合格的方法

第2级定量涉及使用靶向代谢组分析对多余10种代谢物进行绝对定量，用于疾病和毒理表型的诊断。同样需要准备每种代谢物的外标，其方法检验的标准不如第1级验证严格。

第3级：筛选方法

第3级筛选涉及疾病和毒性表型的筛查，主要通过使用多重靶向或混合代谢组学分析对数百个代谢物进行相对或者半定量检测。这并不需要每个代谢物都有相应的外标，用于筛选方法的标准不像第2级验证那么严格。

第4级：发现方法

第4级发现包括通过使用非靶向或混合代谢组学在实验中进行相对定量以发现假定的代谢生物标志物。非靶向方法的标准最不严格。可使用适合系统的QC样品，研究内QC样品，实验室间QC样品，对混合QC样品进行系列稀释等。

靶向代谢组学分析和多代谢物检测

靶向代谢组学研究通常需要对多种分析物进行定量（包括绝对定量，半定量或者相对定量）来进一步探索非靶方法鉴定的潜在生物标志物和验证由此产生的科学假设。靶向与非靶向代谢组学之间的差别很小，通常有重叠。

LC-MS多靶分析允许在同一次分析时检测多种分析物。虽然随着分析物数量的增多，良好的准确性和精密度很难保证，但多靶分析仍比单靶分析提供更多的关于生物标志物的信息。如规章标准所述，在同一次分析中所有的定量分析物需满足同样的接受标准。如果一个分析物未能达到，则这个分析就是失败的。然而，多靶代谢组分析中，如果大多数分析物符合检测标准，没有必要对所有代谢进行重新分析。

此外，可视检测代谢物的数量和分析的目的降低验收标准 （Table 1）。一种考虑是可以将LLQQ的变异从20%增加到30-40%。有一点需要谨记，增加LLQQ重复样品数量会使变异（RSD）变低，并且分析变异度的可容忍度取决于样品的生物变异。分子量大的生物分子通常比小分子代谢物的变异要大，因此FDA推荐的大分子重复分析的变异要小于30%，而小分子则需要小于20%。在本文建议的框架下，第2级的验收标准更为宽松，因为重复样品的数量较少。然而，如果当检测代谢物数量较多时，推荐增加第2级检验的校正点。另外，生物标志物应同时评估其绝对定量和半/相对定量方法。

有关靶向、非靶向和混合代谢组分析产生高质量数据的生物分析方面的考虑

在生物分析不同阶段，良好的实验室规范的重要性都要给予重视。样品、分析物和数据的完整性以及基本的实验记录保存都是必不可少的。非常推荐大家使用实验室信息管理系统。实验仪器的日常校正、移液器和天平有书写清楚并且标准的操作程序、合适空白样品的选择、内标、适合分析系统的测试和不同研究间的QC样品都是必需的。批次间的QC样品应放置在正式分析中，分析样品检测顺序被QC样品分开，以确保整个分析的精度。推荐使用表型（比如健康 vs疾病）QC样品。QC样品通常是将少量的所有检测样品混合制成的，被用于整个分析过程中。对于非靶向分析，强烈建议使用系列稀释的QC样品以帮助区分来自LC-MS化学背景的生物特征。同位素标记标准品的使用可以对不同研究的精度提供一个广义的测量。此外，使用同位素标记的内标可以帮助消除基质导致的离子化效率的影响，因此可以提高分析的准确性。推荐使用合适的替代基质来提高生物标志物定量的灵敏度和选择性。条件允许的情况下，应该使用含有最低含量内源分析物的空白样品。此方法适合多靶分析，但是每一个分析物的基质效应和稳定性应该予以研究。如果没有空白样品，标准加入法可以用来分析检查回收和基质效应。使用QC或者准备的标准品来检测方法的准确性和可重复性是一种假设最少的方法。人工准备的空白基质也可以使用，4% 脱脂牛血清白蛋白溶液（溶解在生理盐水中）可以用作人血浆的空白基质。用于校正样品量不同导致差异的方法也应予以考虑。比如，尿液肌酐常用于校正尿液生物标志物的浓度。

所有的靶向分析都应该对检测限和定量限有明确的定义。必需有信号高于基线噪音清晰可辨的谱峰，谱峰要包含特定的数据点（通常大于等于6个数据点）。作为一般规则，定量限的信噪比（S/N）应该≥5，检测限S/N约为3。这一方法与国际机构的要求是一致的。对于靶向分析，所有峰的信噪比都要进一步确认以保证其达到了要求。然而，对于大规模的代谢组分析，对每个峰进行手动检测并不现实。但是，如果某些代谢物或者特征被判定为离群点，那么这些谱峰需要先进行人工检查来确认差异是真实的还是数据质量问题。