一作解读丨Front Plant Sci拟南芥种子萌发和幼苗生长过程中的代谢变化

众所周知，温度变化会影响植物生命周期中一个关键而复杂的阶段，即种子的萌发和幼苗生长。这个阶段植物体内的代谢物究竟发生了什么变化，其实并不清楚。2023年3月，复旦大学生命科学学院姚红艳副研究员和唐惠儒教授团队在Frontiers in Plant Science上发表了题为“Comprehensive metabolomic and lipidomic alterations in response to heat stress during seed germination and seedling growth of Arabidopsis”的研究论文。研究综合应用高通量非靶向代谢组学和基于“鸟枪法”的脂质组学技术，分析拟南芥种子在适宜温度（22及28℃）和极高温度（34及40℃）下种子发育过程中182个小分子代谢物和149个脂质的代谢变化。

研究结果显示，与有机酸/衍生物和胺有关的代谢在适宜温度下明显富集，涉及细胞三羧酸循环、碳水化合物和氨基酸代谢、肽生物合成、苯丙烷类生物合成和吲哚3-乙酸生物合成途径的反应。而在极高温度下，没有种子萌发，但182种代谢产物中有148种高度富集，涉及半乳糖代谢、脂肪酸降解、色氨酸/苯丙氨酸代谢和莽草酸介导的途径，特别是包括生物碱代谢和硫代葡萄糖苷/黄酮/黄酮醇生物合成。在脂质方面，种子的磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）也表现出从温和温度到极端高温逐渐上升的趋势，而磷脂丝氨酸（PS）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）、单半乳糖基二酰甘油（MGDG）、双半乳糖基二酰甘油（DGDG）和磺基喹啉二酰甘油（SQDG）则相反。此外，和22℃相比，种子在28℃条件下的TCA、二糖、核苷酸、多肽、SQDG和脂肪酸生物合成量明显降低，而氨基酸、三糖、PE、PC、PA、PS、MGDG、DGDG和二酰甘油（DAG）更易富集，反应了幼苗快速生长过程中代谢物和脂质的变化。我们非常有幸邀请到第一作者钱文娟博士，请她给我们带来这篇文章全面深入的解读，原文链接：https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1132881。

实验设计与结果
  

1）四种温度下种子萌发/幼苗生长过程中代谢物及脂质的鉴定

我们设置了22℃、28℃、34℃和40℃共4个温度环境，种子萌发与生长的状态如图A所示。可见22℃和28℃适宜种子萌发。我们对种子进行代谢组和脂质组分析，共鉴定182个代谢物（包括氨基酸、胺类、肽、糖类、核苷类、有机酸、吲哚、苯及衍生物、黄酮等次生代谢物），以及149个脂质（包括13个PA，13个PC，18个PE，11个PG，2个PI，4个PS，22个DAG，25个TAG，17个MGDG，24个DGDG，1个SQDG，Cer 34:1和Cer 38:1）。

图1四种温度下代谢物和脂质的整体分析

2）四种温度条件下种子萌发/幼苗生长过程中代谢物和脂类物质的整体分析

代谢物的主成分分析中PC1和PC2分别占总方差的73.6%和10.9%（图1B），脂质组的主成分分析中PC1和PC2分别占总方差的51.4%和20.3%（图1C）。两种组学分析结果均明确地分为两组，分别在22°C和28°C（适温）和34°C和40°C（极高温）下生长，显示适温和极端高温下代谢物和脂质的明显不同。

火山图进一步显示148个代谢物在适温和极高温之间的显著变化（图1D中的红点）。在极高温下生长的种子中，包括碳水化合物（D-Gal α1-> 6D-Gal α1-> 6D-葡萄糖，麦芽三糖，甘露糖，水苏糖，棉子糖），黄酮类化合物（芦丁，槲皮素，槲皮素）和色氨酸代谢衍生物（犬尿酸，色胺）等共94个代谢物显著增加，另有54种代谢物显著降低，包括苯丙烷类生物合成（芥酸盐，4-羟基肉桂酸，亚精胺），TCA代谢物（琥珀酸盐，柠檬酸盐，甲羟戊酸）等。

基于火山图分析的差异代谢物，我们进一步进行了通路富集分析（图1E）。在这些重要途径中，苯丙素生物合成途径和苯丙氨酸代谢途径，与糖代谢相关的半乳糖代谢发生了明显的改变。其他能量代谢途径如TCA，硫代葡萄糖苷生物合成途径，乙醛酸和二羧酸代谢途径也有明显差异。而多种氨基酸代谢途径，包括丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢，酪氨酸代谢，赖氨酸降解，色氨酸代谢，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解/生物合成，苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成和β-丙氨酸代谢的富集表明氨基酸代谢在维持温度应激期间的代谢稳态中起关键作用。脂肪酸降解途径的显著改变表明脂质代谢对种子萌发和幼苗生长的显著影响。莽草酸介导的代谢途径包括黄酮/黄酮醇生物合成和萜类化合物也与温度反应有关。

3）四种温度条件下种子萌发/幼苗生长过程中代谢产物的显著差异

为了进一步研究代谢物在不同温度下的意义，热图（图2及补充图1,2）分析了代谢物的变化。与极端高温相比，只有33种代谢产物在22°C和28°C下均明显富集，主要涉及TCA循环（柠檬酸、琥珀酸、异柠檬酸）、β-丙氨酸代谢（亚精胺、硫胺、甲基酪胺、丙氨酸）、苯丙氨酸代谢（3-羟基苯乙酸、2-羟基苯乙酸），嘌呤代谢（腺嘌呤、腺苷）、酪氨酸代谢（4-羟基肉桂酸、3-甲氧基-4-羟基苯乙醇醛、3-羟基苯乙酸）、苯丙烷类生物合成（亚精胺、芥子酸、4-羟基肉桂酸）、糖代谢（d-木糖、乙酰葡萄糖胺-1-磷酸）和肽类生物合成（kyotorphin）。与22 °C相比，仅在28 °C富集的代谢产物有17种，主要是氨基酸/衍生物，包括天冬酰胺、缬氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、组氨酸和苏氨酸、N5-乙基-L-谷氨酰胺和N5-苯基-L-谷氨酰胺及氰氨酸代谢（酪氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸），乙醛酸和二羧酸代谢（谷氨酰胺），ATP结合盒转运蛋白家族（谷氨酰胺，组氨酸）和酪氨酸介导的各种次级代谢物的生物合成途径，包括苯丙烷类生物合成，硫代葡萄糖苷生物合成，异喹啉生物碱生物合成，甜菜碱生物合成，泛醌和其他萜-醌生物合成。

图2适温和极端高温下代谢物的比较分析

4）植物激素在不同温度下成苗过程中的变化

本研究还发现了一些与植物激素生物合成有关的代谢产物，特别是生长素、水杨酸和乙烯的生物合成。检测到生长素生物合成的所有前体和中间体，发现色胺，吲哚-3-乙腈，吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乙酰-β-1-D-葡萄糖苷的两种旁路的前体（色氨酸）和中间体在34°C和40°C富集（补充图1）；而来自色胺形成生长素的吲哚-3-乙醛在22°C和28°C富集（图2A），表明生长素合成的三种途径响应不同的温度条件，并且来自中间吲哚-3-乙醛的旁路可能是促进中温下种子萌发的主要途径。从芸苔素中生物合成吲哚-3-乙腈是十字花科成员的独特性状，并且被证明也用于在干旱胁迫下合成拟南芥生长素。在我们的研究中，葡萄糖芸香素在22°C时较高，吲哚-3-乙腈在28°C时积累，这可能表明该途径也被用于在升高的温度下合成生长素。

水杨酸生物合成的中间体（4-羟基肉桂酸，4-甲基水杨酸）在22°C和28°C明显富集（补充图1，图2A），这表明水杨酸可能参与促进中温下的种子萌发。乙烯生物合成中间体S-甲基-5’-硫腺苷和腺嘌呤在22°C和28°C时明显富集，22°C时的富集程度高于28°C，说明22°C可能是拟南芥种子萌发阶段的最佳温度。

5）不同温度下幼苗成苗过程中磷脂和酰基脂肪酸的变化

磷脂不仅作为膜结构还作为信使在植物发育中发挥重要作用。利用火山图分析了温和温度和极高温度之间的显著差异，确定149种脂质中有104种脂质发生了明显的变化（图3A）。总脂类PC、PE、PS、PA和PG在温和温与极高温之间存在显著差异，而PI和神经酰胺对温度的响应没有显著差异。PC、PE在22 °C和28 °C到34 °C之间呈上升趋势。相反，PS、PA和PG在22°C和28°C富集。与22°C相比，28°C时种子的PS和PA均明显富集。总体结果表明，在种子萌发和幼苗生长过程中，磷脂对温度的响应有增加的趋势。另外，我们发现大多数种类的磷脂酰乙醇胺，PE（34:2,34:3,36:6,38:3,38:4,38:5,38:6,40:2,42:2）和磷脂酰甘油，PG（34:0,34:2,34:3,34:4,36:3,36:5），所有种类的磷脂酰丝氨酸，PS（34:2,34:3,40:2,40:3）和磷脂酸，PA（32:0,32:1,34:2,34:3,34:4,36:2,36:3,36:4,36:5,36:6,38:2,38:3,38:4）在中温下倾向于增加，而其他PE脂质分子和大多数磷脂酰胆碱PC，在极高温度下倾向于具有高水平（图3B，4A，5A），这表明磷脂对温度的反应是不同的。脂质不饱和度与膜脂流动性密切相关，可能影响膜的生理效率。分析了磷脂在中高温和极端高温下的酰基脂肪酸（FA）链长和不饱和度。所有具有长脂肪酸链和更多不饱和度的PC都在高温下积累；而具有短脂肪酸链长度的高饱和PC在高温下趋于增加（图3C）。同样，PE（32:0,32:1）也在高温下富集（图3D）。而不同脂肪酸链长度和不饱和度PS和PI在高温下都表现出相似的下降趋势（图3E，F）。具有长脂肪酸链和多不饱和度的PA和PG物种在高温下减少，特别是PA（34:4,36:4）和PG 34:3（图4B，5B）。

图2适温和极端高温下代谢物的比较分析

6）不同温度下幼苗成苗过程中甘油脂和半乳糖脂的显著差异

DAG在脂质代谢中发挥重要作用，可产生TAG，并作为生物合成磷脂中间体PA和半乳脂MDGD的底物。与其他温度相比，DAG在28°C富集，但在温和温度和极高温度之间没有显著差异。具有不同不饱和度的DAG分析发现具有一个双键的DAG（32:1,34:1,36:1）在温和温度下积累（图4C）。在幼苗生长期间，TAG在甘油脂中含量最丰富，并且在极端高温下更加富集（图4D），并且脂肪酸链长和不饱和度分析表明，饱和TAG（52:0）在高温积累（图4B）。

PG是叶绿体膜的重要组成部分，也是生物合成半乳糖脂的底物，它表现出与半乳糖脂类似的改变趋势（图5B）。半乳糖脂（MGDG，DGDG，SQDG）的改变类似于甘油脂，并在温和温度下富集（图5A）。半乳糖脂的脂质不饱和度在极端高温下都降低（图5C，D）。文献报道，降低的半乳糖脂（MGDG和DGDG）可能会阻断质体的形成。

图4&图5四种温度下脂质的比较分析

7）28°C下幼苗发育中至关重要的代谢物和脂类

根据种子在适温和高温下萌发和幼苗生长过程中代谢组和脂质组的特征，我们进一步分析了22°C和28°C温度下种子代谢组和脂质组的差异。在22°C和28°C之间，共有59种代谢物和50种脂质存在显著差异，其中包括23种氨基酸，10种糖/衍生物，9种有机酸，5种CoA，2种嘌呤/衍生物，2种尼古丁/衍生物，1个吲哚，1种酚，13种PE，10种PC，7种PA，5种MGDG，4种DGDG，4种DAG，3种PG，2种PS，1种SQDG和1种神经酰胺（图6A，B）。

在22℃，糖类、脂肪酸、核苷酸和多肽含量显著增加，与糖代谢、TCA、脂肪酸代谢有关，核苷酸代谢，生物活性细胞周期蛋白二肽和三肽代谢相关（图6C）。然而，检测到的大部分氨基酸，包括L型，D型和D/L-异苏氨酸，都倾向于在28°C富集。

种子发育过程中磷脂、DAG、糖脂在22°C和28°C之间的富集程度不同（图6D）。其中，在28°C种子发育过程中，SQDG36:6和PG34:4含量特别低。而其他种类的脂质，如PC（32:0,34:3,34:4,36:4,38:5），PA（32:0,32:1,34:2,36:2,36:3,38:2,38:3），PE（32:1,32:2,34:2,34:2,34:4,36:2,36:3,36:4,38:2,38:3,38:4,38:5,40:2）及所有的PS脂质分子在28°C含量较高。低不饱和的脂质如PG（32:0），DAG（32:0,36:0），MGDG（34:1,34:2,34:3,36:1,36:2），DGDG（34:2,36:3,38:3,38:4）等在28°C时其含量较高。

图6拟南芥幼苗在适温条件生长的代谢物和脂质的比较分析

讨论

半乳糖代谢在细胞壁生成中起着重要作用。半乳糖是许多初级多糖的组成部分，而UDP-D-Gal是细胞壁中半乳糖脂、N-聚糖和各种复合碳水化合物生物合成的供体核苷酸糖（GeorgJ Seifert等，2002）。UDP-D-Gal在34°C和40°C的极端高温下的种子中的含量显著低于适宜温度22°C和28°C萌发的种子。它可能会阻碍细胞的增殖和分裂，从而阻止种子的发芽。

在种子萌发过程中，利用TAG脂肪酶将脂质水解为游离脂肪酸和甘油，产生糖、氨基酸和碳链合成所需的能量。脂肪酸的β-氧化所产生的代谢产物，进入TCA循环，产生ATP的电子传递链。甘油被磷酸化成磷酸二羟丙酮，进入糖异生过程。此外，β-氧化产生的乙酰辅酶A可被送到乙醛酸循环，然后进行糖异生，产生蔗糖等糖，以维持种子萌发后的胚胎生长（Quettier and Eastmond，2009）。蔗糖可作为渗透溶质，保护细胞分子结构和膜稳定性（Fu等，2010; Daloso等，2016）。在这里，我们观察到在极端高温下蔗糖的积累，这可能表明种子细胞在热胁迫下存在水分平衡紊乱。

氨基酸有助于种子贮藏蛋白质的合成，是一种极好的能量来源。因此，改变它们的水平将影响种子萌发和幼苗生长（Cohen等，2016; Xing and Last，2017）。据报道，与较低水平的TCA中间体相关的赖氨酸含量增加通过影响拟南芥种子中核糖体蛋白基因，应激相关基因，胚胎发生相关基因和光合作用相关基因的表达导致较低的发芽率。在我们的研究中，赖氨酸和蛋氨酸的水平显著增高，异亮氨酸和苏氨酸在高温降低，这可能表明从天冬氨酸到赖氨酸的转化增强。我们还发现TCA中间体（柠檬酸盐、异柠檬酸盐、琥珀酸盐）含量较低，提示在极端高温下种子萌发和幼苗生长失败的潜在机制可能与抑制胚胎发生相关基因的周转和刺激光合作用相关基因的表达有关。

磷脂作为细胞膜的主要成分，在植物的温度适应中起着至关重要的作用（Harwood，1991; Harwood，1994）。高不饱和度能增加膜的流动性，并能维持膜的生理效率。在热应激下，发现花生的膜脂不饱和度显着降低，并且在内质网和质膜中积累的陆生植物中饱和和单不饱和磷脂水平增加（Higashi和Saito，2019; Zoong Lwe等，2020）。在拟南芥种子中，PA、PG和PS的脂质水平在极端高温下显著降低;而主要的膜脂，特别是PC和PE，在极端高温下呈现完全不同的趋势，其PC和PE的不饱和度降低，这可能导致膜流动性减少，然后进一步抑制种子萌发。

半乳糖脂的形成是通过将半乳糖从UDP-半乳糖转移到DAG中来实现的。两种半乳糖脂质MGDG和DGDG约是植物中类囊体脂质的约80%（Carter等，1956; Bastien等，2016）。通过MGDG合酶将半乳糖转移到DAG上合成MGDG，通过DGDG合酶将MGDG半乳糖化合成DGDG（Dörmann等，1995）。PA是半乳糖甘油脂的重要前体，是膜形成的必需脂质（Dubot等，2012）。由PA水解产生的提供给MGDG合成酶的DAG，并且拟南芥MGDG合成酶（MGD1）被PA和PG激活（Dubot等，2010）。低不饱和度PA（32:0,32:1,34:2,36:2,36:3,38:2,38:3）和低不饱和度MGDG和DGDG在28°C富集，表明PA，MGDG和DGDG被28℃诱导积累。当PA显著减少，MGDG和DGDG在极高温度下也处于低水平。萌发需要增加MGDG和DGDG以允许在芽中形成质体（Yu等，2015; Hu等，2018），因此种子萌发的热抑制可能是通过阻断MGDG和DGDG的合成而引起的，并且可能是通过PA，在极高的温度下抑制种子萌发。

植物激素乙烯及其直接前体（1-氨基环丙烷羧酸）可以改善种子萌发（Arc等，2013）。乙烯和油菜素内酯通过抵消脱落酸促进萌发的作用影响ABA/GA的平衡（Koornneef等，2002）。生长素（色胺、吲哚-3-乙醛）、水杨酸（4-羟基肉桂酸、4-甲基水杨酸）和乙烯（S-甲基-5’-硫代腺苷、腺嘌呤）的生物合成中间体在22°C和28°C下明显富集，为进一步探索生长素和水杨酸在种子萌发和幼苗生长中的作用机制提供了线索。文献报道，与20°C相比，在29°C时，生长素被温度募集以调节下胚轴伸长的较高生长速率（Stavang等，2009）。在我们的研究中，较高的28°C也可能诱导较高水平的色胺和吲哚-3-乙醛生物合成生长素以促进幼苗下胚轴伸长。

我们的研究显示种子在热应激下萌发的代谢改变，包括糖，氨基酸，植物激素和脂质（图7），这与之前关于热应激下植物转录组学的研究互相验证。秦等发现，小麦叶片中有22个糖转运蛋白对热胁迫有反应，其中3个糖转运蛋白上调，19个糖转运蛋白下调（Qin等，2008）。在热胁迫下，种子中糖的富集与糖运输能力的降低得到交叉验证。此外，热应激下水杨酸代谢（Li等，2010）和氨基酸代谢（El Kereamy等，2012）的基因水平增加与水杨酸和总氨基酸含量增加的结果相呼应。热应激还抑制甘油脂和原核甘油脂代谢的基因表达，其与PG，MGDG和TAG含量降低验证（Higashi等，2015）。编码参与从内质网到叶绿体的脂质转移的三乳糖基二酰甘油（TGDs）的基因以及在Kennedy途径中编码甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPATs）和磷脂酸磷酸酶（PAPs）的基因在热应激幼苗中表现出较低的表达水平（Zhang等，2022），这些基因的转录水平与高温胁迫下苗期PA和DAG的减少一致。脂肪酸去饱和3（FAD3A和FAD3B）基因活性降低导致脂肪酸饱和度降低，特别是热应激下的PC和PE，结果同样相符（Zoong Lwe等，2020）。

植物应激记忆可以使植物对未来的应激变得更具抵抗力。压力记忆形成的一个分子机制可能是染色质重塑，这可能导致支撑记忆反应的基因表达模式发生变化。另一个可能的记忆形成机制涉及几个关键蛋白质，信号代谢物和转录因子的变化（Sharma等，2022）。在红海藻中，亚致死暴露于高温应激通过改变脂肪酸组成改变膜的流动性，导致获得热应激记忆和更好的存活（Kishimoto等，2019）。FORGEtTER2蛋白磷酸酶（FGT2）和磷脂酶Da2（PLda2）之间的相互作用导致拟南芥的热应激记忆，表明膜磷脂代谢的动力学和热应激记忆下的成分变化（Urrea Castellanos等，2020）。此外，糖不仅作为能量库在应激期间，而且作为信号分子的功能。初级糖代谢基因醛缩酶6（FBA6）与干细胞调节因子CLavATA1（CLV1），CLV3和HEAT SHOCK蛋白17.6A（HSP17.6A）参与硫腺苷甲硫氨酸（SAM）的热应激转录记忆（Olas等，2021）。植物激素生长素也通过刺激下胚轴表皮中的AUXIN响应因子表达在应激记忆中起关键作用，其激活细胞扩张促进基因（Rai等，2020）。在本研究中，水杨酸信号、生长素信号、氨基酸/糖代谢、脂质信号或膜脂饱和度可能与热胁迫下幼苗发育过程中热应激记忆的获得有关（图7）。

图7热胁迫下种子萌发过程中代谢物和脂质的主要变化

总结

种子萌发是一个复杂的生物过程，涉及许多代谢途径和代谢产物的改变。在这项研究中，我们使用非目标质谱法和先进的电喷雾技术来获得代谢组和脂质体的综合概况，包括萌发和未萌发的幼苗对不同温度的反应。结果表明，在极端高温（34 °C，40 °C）条件下，大量（148个）代谢产物和特异性脂质高度富集，涉及半乳糖代谢、脂肪酸降解、色氨酸/苯丙氨酸代谢和莽草酸介导的途径（生物碱代谢和硫代葡萄糖苷/黄酮/黄酮醇生物合成）和磷脂代谢（PC，PE）。而TCA、碳水化合物和氨基酸代谢、肽类生物合成、苯丙素类生物合成、IAA生物合成途径和脂类（PS、PA、PG、MGDG、DGDG、SQDG）在22 °C和28 °C时表现出较高的水平，尤其是氨基酸代谢产物、三糖、PE、PC、PA、PS、MGDG、DGDG和DAG在28 °C时更易富集。此外，在22 °C下，TCA分子、二糖、核苷酸、多肽、脂肪酸的生物合成、糖基青霉素介导的IAA和SQDG均明显升高。

研究结果表明，在种子萌发和幼苗生长过程中，在22 ~ 34 °C的不同温度条件下，有明显的代谢产物和相关的调节代谢途径及细胞代谢途径的变化趋势。我们的综合代谢组和脂质组特别指出：1）植物激素，如生长素生物合成的旁路可能在不同温度下被激活，SA可能与热应激反应有关；2）大多数脂质倾向于在中等温度（22 °C和28 °C）下积累，而严重热（34 °C和40 °C）相反导致大多数脂质下降；3）大多数代谢物被诱导高度富集以抵抗严重热应激（34 °C和40°C）；4）在中温（22 °C和28 °C）条件下，与细胞TCA有关的有机酸/衍生物和胺类、碳水化合物和氨基酸代谢、肽类生物合成、苯丙烷类生物合成和IAA生物合成途径明显富集。由于全球变暖，热应激对农作物来说是一个越来越大的风险。我们的研究结果对于综合代谢产物和脂质表型的研究至关重要，为耐热功能创新提供了线索。