新文速递丨Ind Crops Prod元素组评价草果道地性
草果干燥的成熟果实或种子是东亚和东南亚，特别是中国重要的食品添加剂、香料和药物，地理产地关系到它的整体品质和商业价值。复旦大学人类表型组研究院、云南中医药大学以及河南中医药大学合作，通过ICP-MS建立了一种定量元素组学方法，构建了包括58种元素的草果种子元素谱，发现草果所含常量必需元素均值范围较窄，非必需元素除Na、S、Cr外均呈现较宽范围。32种元素（Li，B，Na，Mg，Al，Si，P，S，K，Ca，V，Cr，Mn，Fe，Co，Ni，Cu，Zn，Ge，As，Rb，Sr，Mo，Ag，Cd，Sn，Cs，Ba，La，Ce，W，Pb）的多元素指纹图谱及十五种元素（B，Mg，Al，P，S，K，Ca，V，Mn，Fe，Co，Ni，Sr，Mo，Ba）浓度的组合可用于判断草果种子道地性。相关研究成果于2023年1月发表在Industrial Crops & Products杂志上，文章标题为“Multi-element fingerprinting approach for geographical authentication of Amomum tsaoko seed”，原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669023001097。
研究背景
草果为姜科多年生草本植物，其干燥成熟的果实或种子是东亚和东南亚重要的食品添加剂和香料，在中国常用于治疗寒湿内阻、脘腹胀痛、胀满呕吐、疟疾寒热、瘟热等。近年来，由于消费增加和草果野生种群的逐渐消失，草果的人工栽培面积有所增加，而草果的质量通常受产地的影响。基于元素组成的指纹图谱方法已被广泛用于道地性研究，目前几乎没有关于草果中元素含量的报道，此外草果中元素浓度水平之间的相关性也尚不清楚。本研究利用ICP-MS建立了一种有效的定量元素组学技术，研究来自12个产地（表1）的草果种子道地性。
表1. 草果产地等信息
研究结果
1.元素概况
草果样品中元素检出情况如图1所示，常量必需元素是维持植物生长和完成其生命周期所需的基本元素，表现出较窄的范围。草果种子常量必需元素的平均质量分数由大到小依次为：Cu > Zn > K > Ni > B > Mg > P > Ca > Mn > Fe > Mo。相比之下，非必需元素除了Na、S和Cr（图 2 A）之外，尤其是Ba、Ti、Br、Sn、Cl、Zr、Ga、Y、Ag、Tl、Nb、U、Th、Bi、Hf、Au，呈现较宽范围。重金属分布于植物的各个部位，通过食物链影响人体健康。当重金属在体内蓄积时，可能会竞争性取代必需元素，比如Cd会取代存在于金属硫蛋白中的Zn，从而导致Zn代谢紊乱，抑制细胞中自由基清除。此外，重金属的积累导致抗氧化失衡并影响酶的功能和多种激素的活性，As（主要是无机As）、Cd、Hg和Pb具有很强的毒性，可能对人类和动物的健康产生不利影响。
图1. 所有样品都检测到加粗黑色字体（有色背景）所示的元素，其中浅黄色背景黑色字体元素（Be, Se, Ru, Rh, Pd, Te, Ta, Re, Os, Ir, Pt）在所有样品中低于定量限（LOQ）
FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会确定了角叉菜中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 3×103 µg/kg，Cd < 2×103 µg/kg，Hg < 1×103 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg），中国药典委员会确定了19种草药中As、Cd、Hg和Pb的最高含量（As < 2×103 µg/kg，Cd < 1×103 µg/kg，Hg < 2×102 µg/kg，Pb < 5×103 µg/kg）。在本研究中，As含量范围为20.3-52.5 µg/kg，Cd为16.3-117.1 µg/kg，Pb为8.8-42.5 µg/kg。同时，汞的水平描绘了种群之间的明显分离。在GS、FG、PB、JP和TC这些产地的草果中，所有样品汞含量均低于LOQ。YY的水平最高，为117.1 µg/kg。然而，它们都远低于最高水平，这显示了草果种子的安全性。
图2. 草果种子的元素概况 (A) 每个群体中可定量元素的平均浓度。(B) 草果种子所有样本的平均浓度及其变异系数（CV）均高于100%。
镧系元素被植物根系从土壤中吸收，因此可作为地理标记在食品工业中应用。本研究测量了13种镧系元素。但是，所有样品中只有Ce、La和Pr高于LOQ。对于非常接近LOQ的Er和Tm，仅在GS中能定量测到。此外，Yb和Tb在两个种群中被定量测到，Ho在三个定量中被量化（图 2A）。因此，单独的镧系元素无法作为草果种子的标记物。
2. 元素相关性
对58种元素进行相关性分析，在图3A和图3B中，相关系数被分别描绘为p < 0.05，p < 0.001的彩色点。元素Mg、S、B、P和K彼此呈正相关。其中Mg、S、B、P与Ni呈正相关，S、B、P、K与Fe呈负相关，S、B、P与Mo呈负相关，P、K与Sb呈负相关。Mn、Cd、Zn，Tl之间呈正相关，与Mo呈负相关；Mn、Cd与Ga、Ag、Co、Br呈正相关，与Ca呈负相关。同时，观察到元素Th、Gd、U、Y、Dy、Pr、La、Ce、Nd、Bi、Al、V之间呈正相关，同时与Tm、Ho、Tb、Er也呈正相关。Tm、Ho、Tb、Er、Yb呈正相关。Pr、La、Ce、Nd与Rb呈负相关。值得注意的是，Ga、Ni、Cu，Ge、Pb、Cs，Sr、Ba、Sm元素之间存在显著的正相关。此外，元素Ga和Ag、Co和Br、Ti和Zr、Si和Fe、Fe和Sb分别彼此正相关。同时，Mo与Na、Co、Br呈负相关。在现阶段，虽然很难阐明这些关系，但它们为草果的生理学研究和质量标准的制定提供了重要的依据。
图3. 58种元素之间的相关性。正相关用红点表示，负相关用蓝点表示，点的权重代表相关系数的值。(A) 相关系数显示为彩色点，p < 0.05。(B) 相关系数显示为彩色点，p < 0.001。
3.道地性分析
对58种元素与经度、纬度、海拔高度进行相关性分析。相关系数等于或大于0.5且p值小于0.05作为报告数据的限值。如图4A所示，经度与B、Mg、P、S、Co呈正相关，与Sr、Fe、Sm呈负相关。纬度与Sr、Fe、Mo呈正相关，与Ba、B、Mg、P、Co呈负相关。海拔与Ba、Sr、Fe、Co、Sm呈正相关，与Mg、P、S、Mo呈负相关。涉及的元素有十种，其中B、Mg、P、Fe、Mo各占一半，为必需元素，Sm为镧系元素，随后进行层次聚类分析，采用Pearson距离和ward聚类方法，结果如图4B所示，很难将其与地理起源联系起来，表明草果种子中元素的积累不仅受位置的影响，还受土壤、气候等其他因素的影响。
根据“80%规则”，超过80%样本中，质量分数已知的32种元素（Li、B、Na、Mg、Al、Si、P、S、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Sr、Mo、Ag、Cd、Sn、Cs、Ba、La、Ce、W、Pb）用于进一步层次聚类分析如图5A所示。来自12个种群的样本被分为三类。第1组包括LC、YJ、TC、JP和YY。第2组包括PB、HK和MG。第3组由DLJ、GS、FG和LS组成。除了JP外，与之前关于草果种子精油与局部生长之间相关性的研究中显示的模式相似。根据植物区系理论，JP与PB、HK和MG（第2组）一起位于II区。然而，JP在地理上比PB更接近YY（图 5B），需要在以后的研究中给予更多的关注。然后通过OPLS-DA分析，结果表明组1 vs组2、组1 vs组3、组2 vs组3均有显著差异，Q2大于0.95 和p值小于5.25×10-23（图 5C-E）。这意味着这32个元素可用于构建草果种子地理鉴定的指纹识别模型。
图6. 15种元素的层次聚类分析(HCA)，通过多变量ROC曲线分析过滤。(A) 不同组的HCA。(B) 不同种群的HCA。
LS和TC在地理位置上彼此靠近。在以后的研究中也需要更多的关注。ROC过滤的15种元素包括9种常量必需元素B、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Ni、Mo和6种非必需元素Al、S、V、Co、Sr、Ba。与过滤80%的32种元素相比，缺失了Li、Na、Si、Cr、Cu、Zn、Ge、As、Rb、Ag、Cd、Sn、Cs、La、Ce、W和Pb。但是，在32种元素组合中，有As、Cd、Pb这三种有毒元素和两种镧系元素La、Ce。由于有毒元素在食品添加剂和草药中非常重要，32元素的组合在质量控制中也起着至关重要的作用。
讨论
本研究描述了草果种子中的元素分布，所有样品中69种元素中有11种（Be、Se、Ru、Rh、Pd、Te、Ta、Re、Os、Ir和Pt）低于LOQ。结果表明，常量必需元素的范围很窄，而非必需元素除Na、S和Cr外均呈现较宽的均值范围，有毒元素方As、Cd、Hg、Pb的质量分数均在安全范围内，镧系元素无法单独作为草果种子标记物。此外，目前的研究已经显示出58种元素之间的相关性。尽管很难阐明这些关系，但它们为草果生理学研究和制定草果质量标准提供了重要依据。元素与经度、纬度、海拔的相关结果很难与地理起源联系起来，草果种子中元素的积累不仅受到地理位置的影响，还受到其他因素的影响。80%规则过滤的32个元素组合和ROC过滤的15个元素组合均可用于建立草果种子地理鉴定的指纹识别模型。同时，32种元素组合由于其中含有As、Cd、Pb三种有毒元素对草果种子的质量控制也起着至关重要的作用。
