客户文章丨Front Nutr植物甾醇摄入对小鼠脂代谢的影响
植物甾醇（植物甾醇/甾烷醇）（Phytosterols, PS）是天然的膳食成分，主要来源于植物油、谷类、豆类、坚果、水果和蔬菜。它们与胆固醇（Cholesterol）具有结构相似性，已经证实，PS可以干扰肠道胆固醇吸收，从而实现降低总胆固醇（Total cholesterol, TC）的效果。欧洲动脉粥样硬化协会建议每日摄入2 g PS可有效下调低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平8-10%。重庆医科大学公共卫生与管理学院练雪梅教授团队于2022年在Frontiers in Nutrition期刊上发表题为“Effects of phytosterols' intake on systemic and tissue-specific lipid metabolism in C57BL/6J mice”的研究论文，发现2% PS饮食可以有效降低健康小鼠的循环TC水平，对肝、肺组织脂代谢有特异性调节作用。原文链接：https://doi.org/10.3389/fnut.2022.924236。我公司参与了该研究中游离甾醇的定量检测工作。
研究背景
在PS研究的早期，人们认为PS几乎不可能出现在体内代谢中。目前，越来越多的证据表明，尽管PS的吸收率与胆固醇相比较低，但它确实出现在循环中，且摄入较高后血浆浓度升高。吸收的少量PS被肝脏迅速吸收，并通过脂蛋白运输到不同组织。然而，关于吸收的PS对组织特异性代谢和功能标志物的病理生理作用的证据仍然很少。
研究材料
六周大的健康雄性野生型C57BL/6J小鼠（n=24）随机分为对照组（CS）和PS组（2% PS），PS（44.23% β-谷甾醇、25.95%菜油甾醇、19%豆甾醇和其他）。适应性喂养3周，连续喂养25周后，在1%戊巴比妥钠麻醉下进行动物手术，收集其血样、肝脏及肺部组织。
研究方法
使用迈瑞BS-400自动生化分析仪（中国深圳）测定血清生化指标，包括天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。
使用LC-MS检测血清、肝和肺中游离甾醇。样本提取后再经衍生，经过超高效液相色谱-质谱联用仪（1290-6470 UPLC-MS/MS，安捷伦，美国）分析。
取冷冻的肝和肺组织样品用于RNA-seq基因表达定量。使用Trizol（Takara，目录号9109）从组织中提取总RNA。使用Bioanalyzer 2100系统（安捷伦，美国）的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。在质量控制之后，通过根据有效浓度和目标上岸数据量的要求合并不同的文库来进行Illumina测序，并产生150 bp的成对末端读数。
测定了小鼠不同样本类型中游离甾醇的总浓度，包括血清、肝脏和肺。与CS组相比，2% PS饮食显著增加了小鼠血清和肝脏中的菜油甾醇浓度及其与胆固醇的比率，胆甾烷醇水平及其与胆固醇的比率降低。在肺部中油菜甾醇和胆甾烷醇与胆固醇水平的肝脏比率增加。发现血清中胆甾烷醇与胆固醇的比率和菜油甾醇与胆固醇的比率之间存在显著的负相关。
摄入2%的PS降低了血清TC水平，而TG水平不变。组间比较显示PS组在降低血清LDL-C、非HDL-C和TC/HDL-C水平方面优于CS组。
在肝脏中通过RNA-seq定量了基因表达谱，发现727个上调基因和651个下调基因。GO项富集分析显示显著上调的DEGs被富集到PS喂养的小鼠肝脏中的次级醇代谢、甾醇代谢和类固醇生物合成过程这三个生物过程，KEGG富集分析还通过比较PS组和CS组来鉴定类固醇生物合成和萜类骨架生物合成上调，特别是编码胆固醇级联合成的基因在PS饮食组中以高水平表达。RT-定量PCR和Western blot进一步证实了肝脏中编码胆固醇合成的几种关键酶的表达变化。此外，对小鼠肝组织切片进行定性观察，健康的PS喂养的小鼠没有促进肝脏中的脂滴积累或炎症反应。
在肺中进行的RNA-seq分析显示，两个饮食组之间的基因表达谱不同。与CS饮食喂养的小鼠相比，我们在PS喂养的小鼠的肺中鉴定了1502个上调和1439个下调的基因。与肝脏对PS的反应相反，编码胆固醇合成的基因在肺中的表达减少。GO项富集分析指出下调的DEGs被富集到PS喂养的小鼠肺中的脂肪酸代谢过程。KEGG富集分析还确定脂肪酸代谢、PPAR信号途径、脂肪酸降解和脂肪细胞因子信号途径被下调，PS组小鼠肺中脂肪酸转运和氧化相关基因的表达明显下调。RT-qPCR结果与转录组的结果大致相同。
结论
在本研究中，2% PS喂养28周可有效降低健康C57BL/6J小鼠的循环TC水平。在脂代谢中心器官肝脏中，肝脏通过增加胆固醇合成起到保护作用，以避免循环胆固醇水平不受控制的下降，从而起到平衡功能，因此不会引起明显的肝脏脂质积聚和炎症。在肺等外周组织中，与胆固醇合成相关的基因被下调，脂肪酸运输和氧化基因也被下调，长期补充PS与减少胆固醇合成、脂肪酸转运和肺氧化有关的机制和影响需要进一步阐明。
延伸阅读
关于植物甾醇：天然存在于植物中的一类功能性成分，其化学结构与胆固醇相似，在植物油、坚果和种子中的含量很高，主要包括β-谷甾醇（β-Sitosterol）和菜油甾醇（Campesterol）等，是一类植物激素的前体，它调节植物的生长和发育。在临床试验中，植物甾醇显示出可以阻断人体肠道中的胆固醇吸收位点，因此可以帮助减少人体中的胆固醇水平。美国FDA认可其作为食品添加剂使用，美国心脏协会建议被确诊胆固醇升高时可以补充植物甾醇，但不建议孕妇或哺乳期食用植物甾醇。
关于胆固醇：是哺乳动物体内含量最丰富的甾醇类分子，是细胞膜的基本组分之一，能与邻近脂类分子作用调节膜的刚性、流动性和渗透性，或与跨膜蛋白结合维持或改变后者的构象。胆固醇也是氧化甾醇和甾醇类激素的必备合成前体。胆固醇代谢平衡对维持细胞和机体的生命活动至关重要，胆固醇代谢异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等的发生密切相关。
胆固醇代谢包括内源合成、外源摄取、外排和酯化等四个主要部分。胆固醇合成主要发生在肝脏，通过近30步酶促反应将乙酰辅酶A转化为胆固醇分子，新产生的胆固醇与甘油三酯组装成极低密度脂蛋白（VLDL）分泌到血液中或以脂滴的形式在细胞内储存。饮食中的胆固醇可被小肠细胞内吞，继而组装成乳糜微粒（CM）分泌。VLDL在血液中转变为低密度脂蛋白（LDL），被外周组织细胞内吞，然后被分选进溶酶体，水解释放出游离的胆固醇。这些胆固醇通过溶酶体-过氧化物酶体膜接触等机制被继续运输到其它细胞器或质膜发挥其生物学功能。在大部分组织的细胞中，多余的胆固醇能通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族蛋白外排至血液，与载脂蛋白apoA-I形成高密度脂蛋白（HDL）。在肝、肠细胞中，胆固醇可通过ABCG5与ABCG8外排到胆汁或肠腔，被循环利用或排出体外。过量的胆固醇还可被胆固醇酯化酶（ACAT）转变成胆固醇酯储存在脂滴中，或包裹进到上述脂蛋白颗粒中心，再被释放至血液。这些复杂的过程在多重水平上受严密严格调控，细胞有多种机制能感知并响应代谢状态以维持胆固醇代谢平衡稳态。具体过程及核心调控机制可以参见武汉大学生命科学学院宋保亮教授于2020年在Nature Reviews Molecular Cell Biology发表的题为Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis的综述论文。
