文献分享丨Nat Med肠道菌群可干预肥胖
在我国，糖尿病、心脑血管疾病等慢性代谢性疾病的患病率逐年攀升。肥胖与超重是导致慢性代谢紊乱的主要病因。减肥日益成为大众广泛关心的健康问题，如何能够找到安全有效的减肥靶点是目前亟待解决的科学问题。肠道菌群与人类多种疾病的发生密切相关。西方人群研究表明，肥胖人群存在肠道菌群结构失调，细菌多样性下降，然而在菌种水平导致肥胖发生的细菌仍所知甚少，中国肥胖人群肠道菌群特征又如何？如何影响人体代谢水平？是否可以利用肠道共生菌开发减肥药物？
上海交通大学医学院附属瑞金医院王卫庆教授团队以中国汉族青少年为研究对象，首次揭示中国肥胖人群的肠道菌群组成，发现一个能抑制肥胖的肠道微生物-多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron），并阐述了其对代谢物氨基酸水平的影响，该研究成果以“Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention”（肥胖及减肥干预后肠道菌群和血清代谢物改变）为题于2017年6月19日在线发表在Nature Medicine上。原文链接：https://doi.org/10.1038/nm.4358。
研究思路
在青少年肥胖-正常体重人群队列（GOCY研究）中选择样本，开展肠道菌群宏基因组测序并进行深度解析，首次揭示中国青少年肥胖的肠道菌群组成，发现一系列丰度显著异于正常人群的肠道共生菌，其中多形拟杆菌丰度在肥胖人群明显下降，进一步通过代谢组学分析血清代谢物水平，发现肥胖人群中谷氨酸的含量显著高于正常体重人群，并且其含量与多形拟杆菌数量呈反比。进一步通过小鼠灌胃实验研究证明多形拟杆菌能够降低降低小鼠血清谷氨酸浓度，增加脂肪细胞的脂肪分解和脂肪酸氧化过程，从而降低脂肪堆积，延缓体重增长速度、降低肥胖度。为了进一步证明多形拟杆菌在减肥获益中的作用，研究团队进一步分析了接受减重手术（袖状胃切除术）的肥胖患者手术前后的肠道菌群改变，发现肥胖患者肠道内下降的多形拟杆菌在减重手术3月后即明显升高，恢复至正常体重人群水平，同时，术后血清谷氨酸水平亦明显下降至接近正常体重人群水平。这些研究结果提示，多形拟杆菌水平的恢复可能有助于肥胖患者的减重过程。
通过元基因组关联研究确定肥胖相关基因和分类学改变
我们对257个粪便样本进行了鸟枪定序法分析（第一队列中来自72个肥胖个体和79个瘦对照的151个样本，第二队列中来自23个肥胖个体和26个对照的49个样本，以及来自23个肥胖个体的63个样本，包括6个接受sg的病例组）。我们发现这些年轻、肥胖的个体的基因计数和细菌多样性低于对照组（图1a-c），表明肥胖方面的基因丰富度较低而与种族或年龄无关。还观察到肥胖微生物组的β多样性较高，表明肥胖个体的群落结构比瘦对照组更为异质（图1d）。使用宏基因组关联分析，使用全基因组关联分析，我们确定了350524个与肥胖相关的基因（P<0.01，Wilcoxon秩-总和测试，FDR=0.047）。关联分析也显示P肥胖相关基因显著富集的价值分布具有低P值的标记，表明这些基因与肥胖有关。我们确定了一个由MLG组成的细菌群落，多形拟杆菌、单形、卵形类杆菌、类杆菌，在瘦的对照组中显著富集（图1e）。
图1正常体重人群（左）和肥胖人群（右）的肠道菌群组成差异
肠道微生物种类与临床指标的相关性
为了确定临床参数与肥胖患者肠道微生物组变化之间的相关性，我们进行了排列方差分析（PERMANOVA）。我们发现BMI和27个代谢参数，包括HbA1c、胰岛素抵抗稳态模型评估（HOMA-IR）、血脂浓度、炎症因子和脂肪因子，与肠道微生物组的改变相关（调整后P<0.05；）。在151名受试者的测试集中，26名MLG与BMI表现出最佳拟合（伪R2=0.59），在另外49名受试者的测试集中保持稳定（伪R2=0.36）（图2a）。在最适合BMI的富含对照的MLG中，美洲双歧杆菌、肠双歧杆菌和卵形双歧杆菌的MLG排名最高（图2a）。与受试者测试集中的肥胖个体相比，这些物种在对照组中也高度富集。
瘦素和脂联素是两种脂肪细胞衍生的激素，肠道微生物群定植后循环瘦素浓度增加。结果发现，普氏拟青霉和拟青霉微粒与循环瘦素浓度呈负相关，与循环脂联素浓度呈正相关。D. longicatena与循环瘦素浓度呈正相关，与循环脂联素浓度呈负相关（随机森林回归和Spearman相关值<-0.3或>0.3；图2b），表明这些物种可能构成连接肠道微生物群和代谢状态的潜在生物标记物。
图2肠道微生物种类与临床指标的相关性
肥胖微生物群落的功能特征
我们确定了至少六个样本中存在的5705个京都基因和基因组百科全书（KEGG）直系同源物（KO），其中584个KO在瘦和肥胖受试者之间的丰度不同（P<0.01）。
1）肠道微生物种类与宿主循环代谢产物的关系
为了研究肥胖汉族人群中改变的微生物组与宿主循环代谢产物的关系，我们对病例和对照组的血清进行了非靶向代谢组学分析。与对照组相比，肥胖个体表现出明显的代谢改变。我们确定了148种代谢物，这些代谢物在病例和对照组之间的丰度不同，这使得病例和对照组能够明确分离。在一组单独的病例和对照组中，验证了148种代谢物对病例和对照组的区分。其中，从结构上确定了13种代谢物，包括谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸的靶向代谢组学分析进一步证实了瘦型和肥胖型个体之间丰度的差异。总的来说，34种氨基酸中20种的血清浓度在肥胖个体和瘦对照组之间存在显著差异。为了进一步研究循环代谢物丰度的改变是否与肠道微生物群的改变相关，我们使用共惯性分析（CIA）发现217个MLG和148个代谢物之间的共变异，这些代谢物在病例和对照组之间丰度不同。在典型对应分析（CCA）中，酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和支链氨基酸的载体上清楚地分离了酪氨酸富集型和对照富集型MLG，表明这些氨基酸与肥胖中改变的微生物群密切相关。这些氨基酸与类杆菌的种类呈负相关，包括类杆菌、肠杆菌、卵形杆菌和均形杆菌（斯皮尔曼相关，调整后P<0.05；图3a）。据报道，大叶双歧杆菌和卵形双歧杆菌能够发酵AAA产生苯乙酸。综上所述，我们的结果表明，肥胖患者肠道微生物群的改变，特别是类杆菌属物种的减少，可能与循环中AAA和BCAA浓度较高有关。
在检测到的氨基酸中，与瘦对照组相比，谷氨酸在肥胖个体中表现出最显著的增加。谷氨酸与16种富含肥胖的MLG呈正相关，与18种含有编码谷氨酸代谢相关酶的基因的对照富含MLG呈负相关（图3a）。值得注意的是，富含肥胖症的瘤胃球菌（obesitynriched ruminocococus sp.）、D. longicatena和C.comes以及OB-8293，它们拥有编码从谷氨酰胺中产生谷氨酸所需酶的基因（图3b），与循环谷氨酸水平正相关，与谷氨酰胺水平负相关。这些观察结果提示循环中谷氨酸和谷氨酰胺的水平可能反映了这些细菌种类丰度的变化。
此外，血清谷氨酸与多形拟杆菌的丰度呈负相关（图3a），多形拟杆菌具有编码谷氨酸脱羧酶的基因（K01580，谷氨酸转化为GABA；图3b）。这些结果表明，多形拟杆菌的缺失可能导致肥胖患者血液中谷氨酸浓度升高。此外，血清谷氨酸浓度与肥胖特征呈正相关，如BMI、WHR、waist circumstance,、HOMA-IR、hsCRP和三酰甘油。总之，这些数据表明，肠道微生物种类的氨基酸代谢可能调节与肥胖及其代谢并发症相关的循环氨基酸水平。
图3肠道微生物种类与循环氨基酸的关系
2）形拟杆菌对肥胖和宿主代谢的影响
多形拟杆菌是人类肠道中的优势菌群，它的消耗和肥胖以及血清中的氨基酸浓度相关。基于此，我们研究了肠道中的多形拟杆菌与宿主肥胖之间的可能因果关系。使用未经热处理的活的多形拟杆菌灌胃，显著降低常规饲养小鼠的总体和腹股沟脂肪量并增加了瘦组的体重（图4a-c）。进一步，该措施会减轻高脂肪饮食喂养的小鼠的体重的增加和肥胖（图4d-f）。与用磷酸盐缓冲盐水（PBS）或热灭活多形拟杆菌灌胃的HFD小鼠相比，用活多形拟杆菌灌胃的HFD小鼠的脂联素血浆浓度较高，而瘦素血浆浓度较低（图4g、h）。曾经关于白色脂肪组织的研究表明，给予活的多形拟杆菌比给予PBS（磷酸缓冲盐水）和未经热处理的活的多形拟杆菌的脂肪细胞更小（图4i，j）。此外，与脂肪生成有关的编码蛋白质的基因（包括Srebf1、Scd1和Fasn）的mRNA水平在灌胃活多形拟杆菌的高脂肪饮食喂养的小鼠的白色脂肪组织中较低，而与脂肪分解和脂肪酸氧化有关的基因（包括Adrb3、Pnpla2、Cpt2、Acox1和Ppargc1a）的表达较高（图4k）。高脂肪饮食喂养的小鼠脂肪组织中炎症标记物Cd68、Ccl2、Il6和Il1b的表达因灌胃活的多形拟杆菌而减弱，表明炎症状态有所改善（图4l）。然而，我们观察到三组的空腹血糖或胰岛素浓度及脂肪组织中磷酸化AKT水平没有显著差异。喂饲多形拟杆菌对食物摄入和24小时粪便热量含量均无影响）。值得注意的是，我们检测到，与用PBS灌胃的高脂肪饮食喂养的小鼠相比，用活的多形拟杆菌灌胃的HFD小鼠的循环氨基酸丰度较低，包括谷氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸（图4m）。值得注意的是，有报道称谷氨酸可诱导脂肪分解减少和脂肪细胞增大从而引起肥胖。
16S rDNA扩增子测序显示，与用PBS或热灭活多形拟杆菌灌胃的小鼠相比，用活多形拟杆菌灌胃的小鼠的肠道微生物群组成只有轻微变化，并且在厚壁菌的丰度或拟杆菌/厚壁菌的比率方面没有观察到差异。值得注意的是，我们观察到与用PBS灌胃的小鼠相比，用活多形拟杆菌灌胃的小鼠的肠道中多形拟杆菌的丰度要高得多。综上所述，这些发现表明多形拟杆菌保护小鼠免受饮食诱导的肥胖，并影响循环氨基酸浓度。
图4多形拟杆菌对肥胖和宿主代谢的影响
3）袖状胃切除术对肠道微生物和代谢参数的影响
为了进一步研究肠道微生物群、循环氨基酸和临床表型之间的关系，我们接下来分析了23名肥胖个体在SG后0个月、1个月和3个月的这些参数。体重减轻伴随着代谢改善。我们使用基于病例对照队列中MLG相对丰度的随机森林分类器来区分肥胖个体和瘦个体。使用151个个体的训练集，我们获得了接收器工作特性（ROC）曲线（AUC）下的面积为0.9687，使用49个个体的测试集获得了0.9214。使用与肥胖状态相关的同一分类器进行的分析表明，SG后肥胖个体的肠道微生物组接近瘦个体（图5a）。主坐标分析还显示，0M、1M和3M处的样本从肥胖菌群转移到对照组。此外，在SG后3M，肠道微生物组的基因计数和α多样性显著增加。1M基因计数的短暂减少可能反映了SG后第一个月的饮食变化。这些数据表明，在SG和体重减轻后，肥胖个体中的微生物组与瘦对照组中的微生物组更为相似。
图5袖状胃切除术干预减肥过程中微生物及代谢变化
总结
越来越多的证据表明肠道微生物群作用于肥胖的发展。这项研究结合队列人群、动物及临床干预等多层次证据，证明多形拟杆菌有望成为新的益生菌研发靶点，用于减肥药物或食品研发；该工作为未来针对中国人减肥药物的研究提供了全新的方向和候选菌株。
