文献分享丨JPR三甲胺和氧化三甲胺的生物学功能追溯

2022年3月，澳大利亚莫道克大学的Jeremy K. Nicholson和Elain Holmes团队在Journal of Proteome Research上发表了综述文章“Balancing the Equation: A Natural History of Trimethylamine and Trimethylamine- N-oxide”，总结了TMA和TMAO的检测分析方法以及其在系统生物学中的重要功能。

三甲胺（Trimethylamine, TMA）和它的氮氧化物氧化三甲胺（TMAO）广泛存在于生物界和自然环境中，具有重要的生物学功能，比如细胞信号转导等。血清和尿液中的TMAO作为心血管疾病的危险因素已经引起越来越多的重视，然而这只是TMA/TMAO在众多生物过程中发挥作用中的冰山一角。

1、生物学中的甲胺

甲胺在生物界中广泛存在，由原核生物和真核生物通过特定的代谢通路合成，一部分甲胺也可以通过非生物过程合成 （Figure 1）。甲胺的广泛存在也预示着其在演化生物学中的重要作用。本综述相对全面地总结了TMA和TMAO的生物学功能，主要强调了其对人类生理和病理过程的影响。可以从头合成TMA的微生物广泛存在于多个生态系统中，包括海洋沉积物、淡水和海水中的藻类群落和哺乳动物的肠道。肠道中TMA主要来源是胆碱和甜菜碱的微生物降解或者由食物中的TMAO被肠道微生物还原产生。

Figure 1. (A) Overview of an abiotic formation of methylamine and (B) the four main microbial pathways of TMA metabolism including methanogenesis  (green), anaerobic TMA dehydrogenase (pale blue), and aerobic TMA oxidation (brown) and acetogenesis (black).

由于TMA和TMAO与动脉粥样硬化的发展相关，因此目前受到了大量关注，而它们的其他生物学功能则很少被提起，多年前的有关TMA的古老文献大多被遗忘。Chhibber-Goel等人的综述详细总结了一些鲜为人知的有关TMA的研究历史。虽然化学结构上TMA和TMAO有相关性，但是它们却具有不同的物理化学性质和生物学功能。TMA通常被认为是信息素或者化学信号剂；取决于细胞所处的化学环境，TMAO既可以保护细胞也可以破坏细胞。TMA最显著的特性就是强烈的鱼腥味，鉴于此，它在很的物种中既可以充当化学引诱剂又可以充当驱避剂。在大多数脊椎动物中，TMA在肝脏黄素单加氧酶3（FMO3）作用下生成没有气味的TMAO。TMAO在一些鱼类中可以作为渗透剂行使功能，防止尿素和其他变性作用对细胞蛋白功能的影响，在一些海洋生物和脊椎动物中，TMAO可以充当渗透压、低温和高静水压力刺激的保护剂。然而，有关TMAO稳定蛋白的机制仍然存在争议。基于红外研究和分子动力学模拟，TMAO具有通过增强水的氢键相互作用来削弱肽-水相互作用的功能。详细的有关TMA和TMAO生物学功能的总结见Figure 2.

Figure 2. Summary of exemplar biological functions of TMA and TMAO on various prokaryotic and eukaryotic organisms.

2、甲胺的分析测量

三甲胺TMA最早由Hofmann在1852年正式分离和鉴定出来。与其他胺类物质相似，TMA具有强烈的刺激性气味。TMA的有机/水分配系数很低（氯仿 logP 0.54）；pKa 为9.8；密度为空气的两倍。由于其密度较高，所以在产生TMA的生物周围具有持久的气味。TMA的沸点较低（3 ℃），蒸气压较高（25 ℃时为1610 mmHg ）。TMA可以由有机物、污水和食物残渣（特别是来自食品渔业工业）分解产生，所以其在环境中广泛存在。早在1900年就发现人体组织和体液，比如尿液、血液、粪便、胆汁和精液中也存在TMA。与此同时，发展了大量的生物样品中甲胺及其相关化合物（胆碱、甜菜碱等）的检测方法。环境中的TMA和其他甲胺类物质的检测也使用类似的方法。光谱学技术包括NMR、LC-MS和GC-MS是使用最为广泛的方法。很多LC-MS方法采用多反应监测（MRM）模式选择性地检测特定类型的甲胺类物质。TMAO和TMA的检测通常可以采用高通量模式完成，因为其样品制备过程简单，分析时间较短（GC-MS除外，因为其需要化学衍生化）。TMAO在尿液和血液中相对稳定，多次冻融并不会显著影响其浓度。

3、TMA和TMAO在细菌中的生物学功能

TMA和TMAO可以作为大量生活在海洋、淡水和哺乳动物肠道中细菌的营养物质。甲胺类物质与细菌的关系可以使用基因组技术来研究，可以鉴定出细菌中能够合成或者代谢TMA/TMAO的基因，或者将TMA/TMAO浓度与细菌的类别和种属做相关分析。

3.1海洋和淡水细菌中的TMA代谢

在海洋环境中，特别是来自于SAR11和Roseobacter进化枝的异养细菌能够产生TMA以及氧化TMA。SAR11 α变形菌门为海洋中丰度最高的异养微生物，它的基因组相对较小（1308759 bp），编码了一碳化合物和带有甲基基团化合物，比如甲醇、甲醛、甲胺、甜菜碱、TMA、TMAO和二甲基磺基丙酸酯的氧化途径相关酶。因此，TMA和TMAO是海洋中氮碳循环的重要组成部分。

TMAO为细菌厌氧呼吸的底物，在细菌将TMAO还原成TMA时作为呼吸传递链的末端电子受体。将TMAO还原成TMA也是细菌的特征性代谢。西太平洋深海沉积物中属于γ变形菌门的海洋细菌Shewanella在厌氧生长时使用TMAO、硝酸盐和硫酸二甲酯作为电子受体。

宏基因组分析海洋沉积物发现主要有三种酶参与将TMAO还原成TMA， 它们分别是胆碱-TMA裂解酶（CutC; 主要存在于厌氧海洋沉积物）、TMAO还原酶（TorA; 主要存在于海洋沉积物和开放海域）和甘氨酸甜菜碱还原酶（GrdH; 低丰度）。微生物代谢TMA的四条通路包括乙酸生成、甲烷生成、脱氢和有氧氧化，因此在海洋环境中，TMA代谢的主要产物是乙酸、甲烷、氨和甲醛（Figure 1B）。

细菌的酶要适应其所在的环境条件。比如，静水压力增大会导致海洋细菌TMAO还原酶活性增强，这与适应深海环境中高浓度的TMAO相符。Lidbury等发现在一些海洋细菌中，TMAO的吸收需要特异性的转运体，并且鉴定了一个独特的三磷酸腺苷结合转运体（TmoXWV）。

3.2 哺乳动物中TMA和TMAO的代谢

在哺乳动物中，肠道细菌将食物中的胆碱和肉碱转换成TMA。Falony等已经详细地总结了与TMA产生相关的肠道细菌的基因和种属，与海洋中产生TMA的细菌具有很多相似之处（Figure 1）。在哺乳动物中能够产生TMA的肠道细菌基因包括CutC、肉碱单加氧酶（CntA/B）和GrdH。与海洋环境类似，TMAO还原酶通路在人的肠道中最活跃，主要来自于变形菌门中的克雷伯氏菌和大肠杆菌属，而CutC和GrdH主要来自于厚壁菌门。

肠杆菌科的某些成员也可以将TMAO逆向转化成TMA，在TMAO的循环中也起了重要作用。粪便体外发酵研究表明TMA和双歧杆菌、梭状芽胞杆菌和球形菌相关，因此肠道中TMAO可以促进肠杆菌属的生长。

在人体中，肉食和杂食者比素食者生成TMA和TMAO的能力要强，这与观察所得的食草动物体内不存在产生TMA的细菌酶CntA/B或者低表达CutC以及循环中TMAO水平较低一致。食物中添加肉碱会导致血浆TMAO浓度升高，但是此效应可以被抗生素摄入所抵消，进一步表明微生物在将肉碱代谢成TMA和TMAO过程中的重要作用。大量研究也表明无菌和抗生素抑制的啮齿动物不能产生TMAO。无菌大鼠暴露于正常实验环境后，尿液中TMAO浓度逐渐上升，在大约21天后达到稳态。在传统小鼠模型中，补充肉碱可以导致循环系统中TMA和TMAO升高，同时也导致粪便中Anaeroplasma、Prevotella和 Mucispirillum丰度升高。然而，补充TMA的前体物质γ-丁甜菜碱与升高的Staphylococcus spp.、Akkermansia、 Parasutterella、Prevotella和Bacteroides丰度相关。微生物与TMA和TMAO产生之间的关系在细胞保护以及心脏代谢和其他慢性疾病中的作用也有很多深入研究。

4、TMAO在海洋和陆地环境中作为渗透剂和细胞保护剂

所有的生物都有应对细胞周围溶液渗透压变化的方法。海洋中盐度的变化、细胞中代谢废物的累积、高温和细胞外低温冷冻都可以导致细胞内水分的净流出。渗透剂就是细胞内能够抵抗渗透压影响的分子。无机离子比如钾离子或者不稳定溶质比如尿素可以调节水环境，同时也可能破坏细胞中的蛋白。破坏溶质稳定性的渗透剂有乙醇、尿素和精氨酸等，它们与蛋白表面发生相互作用进而降低自由能，利于蛋白形成非折叠态。尿素可以直接与蛋白骨架中的极性基团比如肽键相互作用从而使蛋白表面分子间相互作用减弱，破坏蛋白的二级和三级结构。它也可以间接地与溶液环境相互作用，改变疏水分子基团的结构和水的动力学来提高溶剂化能力。大多数生物体通过积累相容性的渗透剂来调节渗透压，它们通常是不带电或者两性有机小分子，通过氢键与蛋白的三级结构相互作用来稳定蛋白的结构。溶液稳定型渗透剂通过提升蛋白非折叠状态的自由能来使蛋白易于形成折叠态。它们被生物体广泛地用于抵抗破坏性渗透剂导致的不良效应，保护生命体免于脱水、高盐和极端温度带来的伤害。海洋软体动物、甲壳类动物和鱼类在海水的高渗透压环境中就利用TMAO来调节细胞体积。Yancey等阐明在海洋生物中TMAO是比甘氨酸甜菜碱和甘油更好的渗透剂。在一些海洋生物中，比如甲壳类动物和某些鳃类动物，TMAO是主要的渗透调节剂，其浓度可以高达0.2 M。在哺乳动物和其他生物中，甲胺同样作为无害性渗透剂和细胞保护剂，其可以积累在肾皮质和髓质中以防止脱水和抵消尿素和其他毒素对肾单位的有害影响。TMAO被认为是肾脏的细胞保护剂，因为它可以逆转NaCl和尿素高渗透压导致的茚三酮阳性物质的积累，肾毒素比如溴乙胺和丙烯亚胺等的摄入会导致啮齿动物肾皮质内TMAO积累，同时尿液中排泄的TMAO降低， 但是在肾髓质中TMAO的浓度通常很低。

虽然有很多研究使用多种方法来研究TMAO稳定蛋白结构的机制，但是其详细机制仍然有争议，目前提出的潜在机制主要如下：

1）降低蛋白和水之间氢键的强度：

在生理pH值条件下，TMAO是高度亲水性的，倾向于与水形成氢键。

这增强了水氢键网络的强度从而减弱了水和蛋白极性基团直接氢键的作用强度，导致优先排斥蛋白表面的TMAO复合物。

这种氢键结构增强的水称为“冰山水”，使蛋白骨架蛋白的羰基脱水从而不易形成非折叠结构。

在这种情况下，TMAO作为助溶剂，其通过与水相互作用来增加细胞蛋白和水的混溶性，而并不需要直接与蛋白发生相互作用。

除此之外，在不同压力下的分子模拟和溶解度实验表明TMAO可以通过减弱水氢键和蛋白骨架的相互作用来间接稳定蛋白内氢键结构。

2）分子拥挤：

TMAO被蛋白表面排斥，证据为发现蛋白周围存在水分子拥挤环境，影响了蛋白周围水分子结构从而稳定蛋白结构。

一项最近的分子动力学研究表明TMAO可以提高脂膜上的液/胶转换温度，增强脂分子的排列顺序从而导致更大的堆积密度。

3）肽-尿素溶剂效应的改变：

尿素与蛋白骨架相互作用导致蛋白结构展开。

TMAO可以与尿素的氨基直接作用，从而降低尿素与蛋白的相互作用。

实验已经证明TMAO可以提高溶解温度，增强热稳定和增加蛋白展开自由能。

因此，TMAO可以稳定折叠状态蛋白的结构或者逆转错误折叠和变性的蛋白，比如乳酸脱氢酶。

与以上提出的这些稳定机制不同，Liao等人采用X射线拉曼散射光谱表明其他的渗透剂比TMAO对水结构的影响更强烈。因此，他们推测其机制是TMAO作为折叠蛋白的极性和非极性表面交界处的表面活性剂，而与分子拥挤和氢键并没有关系。

作为细胞保护剂，TMAO以多种方式发挥作用。在海洋环境中，TMAO还可以保护蛋白免于压力变化导致的变性。比如，硬骨鱼肌肉和血浆中TMAO浓度与其生活的深度呈线性相关，暗示TMAO积累与压力相关。在功能方面，升高的TMAO浓度可以降低静水压导致的某些酶的失活，比如乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶。渗透剂在哺乳动物肾中的作用与TMAO在海洋生物中作为蛋白稳定剂的作用相似。当肾脏由于脱水、高尿酸和其他毒素浓度导致渗透压增大时，肾髓质TMAO浓度会增加从而降低酶的解离速度。与此相反，Rani等人发现TMAO可以作为细胞破坏剂。当TMAO处于高浓度时，TMAO可以与蛋白表面甚至整个疏水口袋直接发生相互作用，这会降低蛋白处于展开态的自由能，使平衡向变性方向偏移。

另一个TMAO作为细胞保护剂的例子是其在暴露肾毒素动物的肾组织中累积，提示它可能在组织内积累作为毒素诱导细胞应激的一种响应。在植物界，TMAO在植物中作为渗透保护剂和非生物胁迫诱导基因表达的激活剂，可以提升植物对干旱、高盐和低温环境的抵抗能力。TMAO还被证明能促进微管多聚化，其是真核生物中有丝分裂和胞内转运的必要结构，由微管蛋白和其他蛋白形成的螺旋聚合物组成。甲胺中只有TMAO还可以保护由尿素和低温刺激导致的微管解聚。如讨论所述，TMAO不直接与蛋白相互作用，而是引起氢键增加导致蛋白水和化从而降低蛋白的暴露表面积。然而，即使TMAO在肾脏中浓度很高，但是抵抗尿素导致的微管蛋白不稳定的效应不能完全归于TMAO, 它应该是一个其他非破坏性渗透剂也参与的复合效应。

虽然TMAO的主要作用看起来是细胞保护剂，但是它还有一些其他的用途 （Figure 2），比如一些海洋生物使用TMAO来控制浮力。Withers等人使用分子量和偏摩尔体积计算了血浆和肌肉中的溶质组成，发现TAMO可以提供1.7 g/L的正向升力，密度比大多数溶质比如钠钾离子都要低。另外，在盲鳗受到威胁时会排出大量的由五颜六色粘液团来堵塞捕食者的鳃。这些粘液团通过一种粘附作用而不容易分散，因为其含有高浓度的甲胺，其中就有TMAO、二甲基甘氨酸和甜菜碱。

5、TMAO作为细胞破坏剂

虽然像TMAO这样的渗透剂通常可以稳定蛋白来保护细胞和组织，但是Yancey发现在没有细胞破坏剂的情况下，稳定蛋白可能会带来不利影响。因此，“化学伴侣”或者“抵消溶质”的概念比“相容溶质”更加准确。TMAO能够增强蛋白质和配体结合的稳定性从而抵消很多细胞和组织中的尿素效应，同时它也可以过度稳定失去功能的蛋白聚合物，比如β样淀粉蛋白。有一些研究表明TMAO既可以作为酶的激活剂也可以作为抑制剂，它也不总是能抵消尿素效应。比如，尿素抑制乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶和过氧化氢酶；TMAO激活乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶，对黄嘌呤氧化酶有弱抑制作用，增强过氧化氢酶的热稳定性。这表明TMAO不总是抵抗尿素效应。Mashino等人的研究表明当TMAO选择性稳定催化循环的基态时，会抑制酶的活性；当TMAO选择性稳定催化循环的过渡态时，会对酶有激活作用。TMAO对蛋白稳定性的影响部分取决于所处化学环境的pH值。有一些蛋白，比如朊病毒、溶菌酶、核糖核酸酶A和载脂蛋白-α乳白蛋白，TMAO在pH高于其pKa时增强其热稳定性，低于其pKa时降低其热稳定性。另外一个决定TMAO对蛋白稳定性影响的因素是蛋白折叠的动力学。Kumari等人的研究表明恢复突变蛋白的折叠发生在快速折叠的蛋白中，比如朊病毒蛋白，但是不会发生在慢折叠蛋白，比如碳酸酐酶、辣根过氧化物酶和胆碱乙酰转移酶，因为这些蛋白含有很多脯氨酸残基，TMAO可以稳定中间体并且降低完全折叠蛋白形成的速度。进一步研究表明在碳酸酐酶的慢速重折叠阶段，TMAO抑制了脯氨酸残基的顺反异构，这一效应是TMAO特有的，在其他渗透剂中并没有发现。TMAO处理HeLa细胞会抑制细胞活力，使处于有丝分裂S期的细胞增多。

因此，TMAO与蛋白之间的相互作用比较复杂，有关其对蛋白生理功能的正面和负面的影响均有报道。当阅读文献时，必须要清楚体外实验环境与正常生理环境并不一致，比如物质浓度、pH、温度，在解释实验结果时要加以考虑。

6、TMA的信使功能

TMAO的功能可以宽泛地总结为稳定蛋白，但是TMA的主要功能则是作为化学信号。现有研究已经表明TMA既可以作为化学引诱剂也可以作为化学趋避剂。但是，不同的物种演化出不同的功能，比如信息素的检测、吸引腐烂的食物来源，或者避免捕食者。虽然痕量胺受体的组织分布并不广泛，但是作为嗅觉系统的一部分其可以诱导先天的动物行为反应，存在于所有哺乳动物中。TMA对人类和大鼠是趋避剂，但是对小鼠、苍蝇、蚊子和鱼类却是引诱剂，一些植物则使用TMA对食草动物发出威慑。TMA在各种植物、动物甚至某些真菌的生殖结构中积累，对动物的荷尔蒙和行为模式影响深远，包括一些两栖动物和鱼类的求偶行为。小鼠尿液TMA的排泄已经演化作为它们行为信号模式的一部分，这也一定程度上解释了为什么小鼠尿液中TMA的浓度比大鼠的高。TMA在其他哺乳动物比如牛中也作为化学引诱剂，在发情期奶牛的阴道液中的TMA可以引诱公牛的交配行为。小鼠和一些水生生物比如黑头鲦鱼分泌TMA作为一种领土信号分子。蛇分泌的TMA被认为可以防止天敌捕食。

TMA在水中和脂类溶剂中都可溶，因此可以快速扩散分布至全身。除此之外，它可以透过皮肤，在皮肤表面与空气接触，形成约2.86 atm的蒸气压，使它很容易挥发。但是，因为TMA密度是空气的两倍，在空气中扩散的速度并不快，这就使得分泌TMA的生物可以长期带有TMA，成为合适的化学信使。

TMA对小鼠的引诱性依赖于痕量胺相关受体5（TAAR5），在TAAR5敲除小鼠中，其引诱效果消失。TAAR5在多个脑区均有表达，预示其除了感受气味和调节情绪行为还可能  有其他功能。Espinoza等人研究表明TAAR5敲除小鼠不容易焦虑，并且血清素代谢受到影响，表现为海马中5-羟色胺和5-羟基吲哚乙酸水平降低。

TMAO作为细胞保护剂、TMA作为化学信使的具体生理功能在研究它们对心血管疾病和其他疾病中的贡献时经常被忽视。在理解TMAO对心血管疾病和其它疾病的影响时，全面了解饮食和血液中浓度变化与正常生理水平和节律的关系至关重要。

7、TMA和TMAO的自然变化和生物节律

体液和组织中TMA和TMAO的浓度以及其在人体内的变化受年龄、性别、激素水平、生物节律、饮食和肠道菌群的影响。在健康成年人中，尿液中TMA和TMAO的浓度也会有变化，大多数研究报道的尿液TMAO浓度在6.8-181.2 μmol/mmol 相对肌酐，比TMA的浓度（0.21-0.98 μmol/mmol 相对肌酐）要高出好多倍，在吃了鱼肉后TMAO/TMA的比值还会进一步升高。在尿液中TMA和TMAO随时间的稳定性方面，Li等人发现样品在-20℃放置30天并不会有任何变化，反复冻融5次也不会影响TMA和TMAO的浓度。健康的西方饮食人群空腹血浆中TMAO浓度为3.4-4.5 mM, 在12个月内相对稳定，不会受饮食、生活方式或者是日常生化分析影响。尽管肠道菌群与TMAO相关，但有关正常粪便中TMA和TMAO的浓度信息还不清楚。Fiori等人报道在两个健康志愿者中，TMA的粪便浓度为0.080-0.146 μmol/g, TMAO的浓度为0.015-0.058 μmol/g。

7.1 年龄

人类与肠道微生物在演化过程中共同发展，与TMA/TMAO合成的关系非常明显，这些化学物的浓度会随着年龄变化。TMA和TMAO 的产生主要由微生物将饮食中的胆碱转化而来，大量研究表明抗生素处理会显著降低尿液和血浆中的TMAO含量。TMAO会由婴儿的尿液中排出，浓度会在三到四岁时逐渐下降，提示早期婴儿的肠道微生物可以处理母乳中含量较高的胆碱。一项研究表明早产儿TMAO、牛磺酸和肌醇对肌酐的平均比值比足月儿分别高14.1、4.3和10.1倍，提示TMAO可能作为渗透剂来平衡肾单位生理发育的不完全。

在成年人中，尿液中TMAO会随着年龄增加。一项研究表明，小于45岁的健康成年人TMAO和二甲胺的平均浓度分别为62.5 ± 59.0 mmol/mol 相对肌酐和34.0 ± 6.5 mmol/mol 相对肌酐，大于45岁组分别为81.5 ± 66.8 mmol/mol肌酐和40.5 ± 10.6 mmol/mol肌酐。因为FMO3的表达丰度并不受年龄影响，所以年龄和TMAO和TMA排泄的增加之间的相关性很可能反应了随着年龄的增长肾过滤系统的效率下降或者与年龄相关肠道微生物的改变从而影响TMA的产生。

7.2 性别和激素的影响

尿液中TMAO和TMA的浓度在不同性别动物之间具有显著差异。在脊椎动物中，TMA在雄性动物的尿液中更高。一个可能的解释是TMAO作为一种信息素发挥功能。与此不同，TMAO的浓度在雌性大鼠、小鼠和人类中更高。这一发现与女性肝脏中FMO3的表达丰度更高一致。然而也有研究表明TMAO的分泌不受性别影响。激素对性别差异导致的TMAO和TMA浓度不同的影响还不清楚，但是在人类中发现TMAO水平在月经和更年期更高，雌性大鼠发情期TMAO浓度也较高。相反在男性群体，睾酮的水平与FMO3表达成负相关，这可能是在男性中TMA与TMAO的比值偏高的原因。

怀孕期间孕妇的血液和尿液中TMAO水平的升高也进一步提示激素影响TMAO和TMA。血液中TMAO升高与先兆子痫、全身炎症、内皮功能障碍和血清脂多糖增加相关，这与肠道微生物和肠道屏障完整性的改变一致。血浆TMAO的水平和妊娠糖尿病的关系还存有争议，而TMA的水平与不良妊娠事件包括妊娠糖尿病和胎儿发育迟缓相关。虽然TMA与胎儿生长之间的相关性重复性不好，但是在动物模型中比较清楚，给怀孕小鼠摄入0.75 mM TMA导致胚胎发育减缓约30%，并且73%的胚胎具有神经管发育缺陷。通常情况下，当在培养的胚胎中加入乙胺时，会看到明显的毒性效应，比如胚胎存活、大小以及DNA和RNA含量均有不良影响，TMA、DMA和单甲胺（MMA）毒性依次降低。

7.3 种族

虽然有关不同人群体液中TMA和TMAO浓度差异的报道，但是这些差异更多的是由饮食差异导致的，与种族本身关系不大。比如，瑞典和日本人的尿液中TMAO浓度比英国人要高，主要是因为他们吃了更多的鱼肉。

7.4 昼夜节律

一些证据表明TMAO和TMA的排泄受昼夜节律影响。在小鼠模型中，早晨收集的样品中TMA浓度较高，而TMAO浓度则比较低。在人类中，血液中TMAO浓度晚上比早上要高。睡眠剥夺也会导致尿液中TMAO和其他微生物相关代谢物浓度升高。

8、 饮食与TMAO浓度的相关性

TMA和TMAO的主要饮食来源前体物质是胆碱和肉碱，三甲基赖氨酸和麦角硫氨酸对饮食中的TMA也有少量贡献（Figure 2）。尿液和血浆中甲胺浓度均可以反应饮食摄取的鱼肉、红肉、鸡蛋、奶制品、豆制品、豆类和一些绿叶蔬菜。但是在考虑饮食对血液和分泌TMAO的影响时，应该要清楚不同饮食之间的比较非常困难，因为缺少将不同饮食来源TMAO标准化的方法，比如具体食用了哪种鱼类以及采样的时间点等。饮食干预后个体间的TMAO差异可以高达10倍，这表明除了肾功能和FMO3基因多态性，肠道微生物的组成在个体间存在较大差异。

海鱼的摄入对尿液和血浆中TMA和TMAO的浓度具有强烈的影响，并且与鱼的TMAO含量和种类以及环境都有关系。摄食后TMAO可以升高4.72-50倍，TMA也类似。血浆甲胺浓度在进食15分钟后开始上升，2小时后达到峰值，高水平的甲胺浓度至少可以保持6小时。第二大TMAO饮食来源是肉制品，尤其诸如牛肉等红肉，其含有丰富的肉碱。Wang等人发现空腹尿液和血浆中TMAO浓度在摄取红肉4周后会升高，而同等热量的白肉或者植物蛋白对TMAO水平则无明显影响，这与血液中TMA和TMAO与心血管疾病风险增加相关一致。直接在饮食中添加1.5 g/天剂量的肉碱，持续24周后会导致血浆中TMA浓度升高10倍，但是这与炎性标志物，比如C反应蛋白、肿瘤坏死因子α或者白介素6的变化无关。

饮食中蛋类和奶制品也可以提供少量的胆碱和肉碱，但是比鱼肉和红肉要少的多。有关奶制品对TMA/TMAO水平的影响结果并不一致。一个研究发现摄食奶制品与血浆TMAO浓度正相关，而另一个研究则报道摄入奶制品后餐后血浆和尿液TMAO水平降低。这些研究也从侧面表明比较饮食研究结果的困难，因为方法、研究人群和样品采集很难做到协调一致。与奶制品类似，蛋类摄入对TMAO浓度的影响，有些研究发现其可以提高血液和尿液中TMAO的浓度，而有些研究则没有发现显著差别。为数不多的研究表明素食食物中抗性淀粉与血液中TMAO浓度升高相关。

全膳食对全身和排泄TMAO水平影响的详细评估表明高蛋白饮食可以导致TMAO水平升高，与鱼肉和红肉相关研究一致。一些研究也表明，杂食动物的尿液和血浆中TMAO含量比素食主义者要高。高脂饮食对TMAO的影响结果颇具争议，仅有一项报道在5天的干预期内，血液中TMA浓度仅在进餐后的4小时有一过性升高。有研究表明减肥饮食可以降低血浆中TMAO浓度，一项研究表明血清TMAO浓度降低与胆碱TMA-裂解酶编码属，比如瘤胃球菌属、副拟杆菌属和拟杆菌属相关。但是，如果不考虑饮食中胆碱和肉酱含量的影响，很难从上述实验中得到可靠的结论。

9、疾病状态和紊乱

血液和尿液中TMAO和TMA的浓度与多种病理状况直接正相关，包括心血管疾病、糖尿病、癌症、自身免疫性疾病、多囊性卵巢综合征和自闭症；与其他疾病比如痴呆和炎症性肠病负相关。但是，有关这些疾病的文献结果并不一致，反映了人体与肠道微生物相互作用的复杂性。研究最多的与TMAO相关的慢性病包括心血管疾病、糖尿病和肾病，尤其是血浆TMAO浓度和心血管疾病风险直接的关系。TMAO在心血管疾病发生中的作用仍然存有争议，虽然绝大多数研究认为TMAO和心血管疾病的发生有因果关系，但是一些研究组提议TMAO在人类病理中的作用需要更加全面和综合的考量。TMA/TMAO与心血管疾病方面的研究已经有比较全面的综述，我们在此只简要的总结一下TMAO和TMA与各种疾病的关系，主要关注在原核生物和动物界保守的代谢，重点强调细菌通过TMA和TMAO代谢介导的对哺乳动物病理过程。

9.1 鱼腥味综合征（原发性三甲胺尿症）和一过性三甲胺尿

尿液、汗液和呼吸时分泌过多的TMA会导致身体有腐烂的鱼一样的味道，被称为原发性三甲胺尿症（TMAU, OMIM 602079）。这种代谢紊乱由Humbert在 1970年发现，由FMO3突变导致，FMO3突变使得TMA被氧化成TMAO的活性降低。目前已经有超过40个突变会严重降低FMO3的活性。这种病的诊断主要通过遗传筛选和测量TMAO/TMA比值，一个人如果TMA/(TMA+TMAO)的比值大于10%很可能得了鱼腥味综合征。TMUA患者的TMA水平通常会升高300倍，而TMAO水平也会有轻微升高。

英国白人杂合子的携带率为0.5-1.0%，其他人群携带率可能更高。TMUA的症状通常在出生时就出现了，在青春期和女性月经期会加重。虽然TMUA没有身体上的不适，但是难闻的气味可能导致心理和社会问题。TMUA病人摄入的TMA，70%会以原型排出。虽然抗生素治疗和核黄素补充剂可以用于降低TMA水平，但是目前TMUA患者主要通过饮食限制TMA和TMA前体物质，包括胆碱、卵磷脂和TMAO来治疗，同时建议病人少吃牛奶、鸡蛋、肝脏、肾脏、豆类、芸苔属植物和鱼以及海鲜类食物。

9.2 心脏代谢疾病和肠道菌群的作用

9.2.1. 心血管疾病

 TMAO已被确立为心血管疾病的危险因素和病因之一，在多篇综述中都有所介绍。总的来说，血液中TMAO的浓度与心力衰竭、心肌梗塞、心脏性肾病死亡率、外周动脉疾病和中风相关，并独立于其他传统危险因素。其中一些研究表明血液中TMAO的浓度与下游死亡率相关。两个大的队列分析，共收录了超过一万名参与者，发现血浆TMAO浓度升高使不良心血管事件发生率升高23-58%，全因死亡率增加55%。

目前，关于TMAO与动脉粥样硬化发展的潜在机制有两个假设：第一个是TMAO可以作为疾病的标志物，反映心血管疾病和动脉粥样硬化性肾动脉狭窄，因为它们导致尿液中TMAO降低，同时伴有血浆中浓度升高；第二个是TMAO在疾病发展中起到了决定性作用，因为它可以促进泡沫细胞的累积，从而抑制胆固醇反向转运，影响胆汁酸和固醇代谢导致血小板活性升高来促进动脉粥样硬化斑块形成。作为支持这一因果关系的证据，Zhu等人发现直接将血小板暴露于TMAO可以增强刺激依赖性血小板激活。肠道菌群在TMAO与心血管疾病发生的因果关系中起了至关重要的作用，因为TMAO的产生依赖于肠道微生物将饮食来源的胆碱和磷脂酰胆碱转化成TMA。无菌小鼠不用利用饮食来源产生TMAO，也不会形成动脉硬化粥样斑块。与此相似，通过口服抗生素来抑制肠道菌群既可以抑制TMAO的产生也可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成。将高具有浓度血浆TMAO的促血栓形成小鼠的肠道菌群移植给无菌小鼠也导致被移植小鼠血液中TMAO水平升高，血栓形成的可能性增大。

TMAO可以通过促进NLRP3炎性体来影响血管炎症，导致炎性细胞因子白介素1β和白介素18的释放，抑制一氧化氮的产生。这进一步强调了肠道菌群在TMAO促进心血管疾病中的重要作用。但是，也有一些研究发现血浆TMAO与炎性标志物比如C反应蛋白并无相关性。转录因子FoxO1是代谢疾病的重要驱动因子，可以结合内质网应激激酶PERK。TMAO可以诱导FoxO1表达，通过肠道菌群来降低TMAO水平可以降低PERK激活和肝脏FoxO1水平，进一步表明宿主与肠道菌群相互作用的重要性。

显然，TMAO参与动脉粥样硬化形成，涉及饮食、微生物和宿主信号传导过程之间的复杂相互作用。饮食作为血液中TMAO的来源已经被广泛讨论过，与越来越多的证据表明TMAO与冠心病直接相关相反，摄入富含TMAO的鱼肉长期以来一直被认为与降低心血管疾病风险相关。一些研究报道TMAO的前体物比如肉碱、胆碱或者甜菜碱与主要心血管事件相关，同时也有报道并没有发现相关性，另外还有研究表明心血管疾病危险因素主要是TMA介导的，而不是TMAO。例如，在大鼠模型中，TMA可以导致平均动脉血压升高，而TMAO则没有任何影响。已经有综述文章指出了关于TMAO和它在心血管疾病中作用的理论并不一致。Ufanl等人认为TMAO和心血管疾病的关联在于对心脏功能不全导致的心脏和肾脏静水压和渗透压升高的补偿反应。

9.2.2. 肥胖

肥胖是心血管疾病和2型糖尿病的危险因素，炎症在病程发展过程中起了重要作用。很多研究报道了体重指数与血液中TMAO的浓度存在相关，但是也有阴性结果的报道。血清中TMAO与衡量肥胖的其他标准，比如脏器肥胖指数和脂肪肝指数相关，而尿液中TMA则直接与肥胖相关。

几乎没有研究在排除混杂因素比如饮食影响的健康人群中研究BMI和TMA/TMAO的关系。动物模型是常用的替代研究对象，用来帮助我们理解肥胖-肠道微生物-炎症轴，但是产生的结果喜忧参半。ob/ob肥胖小鼠尿液中TMA水平比对照组要低，db/db肥胖小鼠模型结果也类似。这一结果与在人群中发现的TMA与肥胖程正相关相反。血清和尿液中TMAO水平在Zucker大鼠肥胖/糖尿病模型和肥胖猪模型中均降低。更进一步，在高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型中，饮食添加TMAO可以显著降低动脉粥样硬化指数。

因为肥胖是糖尿病和心血管疾病的最大危险因素，所以从代谢改善以及后续炎症反应降低和促进代谢健康等方面对减肥策略进行了评估。一系列饮食干预和减肥试验已经表明减肥与降低血液中TMAO和心血管疾病风险以及内脏脂肪相关。虽然Lin等发现血清中TMAO水平与骨矿物质密度呈负相关，但是Zhou等人发现TMAO可以保护减肥时骨矿物质密度降低，这与饮食类型无关，提示TMAO可能具有预防骨质疏松的作用。当考虑TMA/TMAO在减肥中这些不一致的结果时，需要清楚很多发表的减肥研究并没有考虑饮食中的TMAO，而涉及长期给予TMA前体的研究通常剂量都超过正常饮食或者治疗补充剂中的剂量，从而导致TMAO在心脏代谢疾病中的作用并不明确。

当饮食和运动减肥失败后，减肥手术是一种治疗个体病态肥胖的策略。减肥手术的重要特点之一是肠道微生物组成和代谢在术后都会发生显著变化，通常在体重减轻之前就发生了。大鼠进行胃绕道手术后，粪便中升高的甲胺（MMA和TMA）浓度与粪浆的细胞毒性正相关。在人和动物减肥手术研究中有一项观察到的结果比较一致，就是术后TMAO排泄增加，这与以厚壁菌门和拟杆菌们为主的肠道菌群向伽马变形杆菌转变有关，尤其是肠杆菌科。这也与肠杆菌是产生TMA的主要细菌相符合。虽然有血液中TMAO与冠心病相关的假设，但是减肥手术可以降低冠心病风险，看起来TMAO的故事很复杂，千头万绪。

9.2.3.  2型糖尿病
胰岛素抵抗和2型糖尿病与血液中TMAO升高相关。血清中TMAO水平与糖尿病病程、肠道通透性标志物、脂多糖内毒素和产生TMA的细菌均相关，TMAO诱导的脂肪组织炎症破坏胰岛素信号通路被认为是背后的可能机制。对于糖尿病患者，TMAO是心血管事件发生的高危险因素标志物。在高脂饮食小鼠模型中，0.2%TMAO处理3周引起空腹胰岛素水平升高，糖耐量加重，促炎因子MCP-1升高，抗炎因子白介素10降低。

9.3. 肾病

多种不同肾病，包括慢性肾病（CKD）、间质性肾炎和肾乳头坏死，都可以导致尿液和血液中TMAO异常。尿毒症是指通常经过肾脏排泄的溶质在肾细胞和组织中累积，对内源性分子功能产生不利影响。TMA以及其他甲胺类物质，包括TMAO、DMA、二甲基甘氨酸和MMA，都被归入尿毒症毒素。血液中TMAO水平过高提示尿毒症，但是过低也可能意味着其他类型的肾功能受损。Gessner等人发现肾小球滤过率每升高1 mL/min，血浆logTMAO值降低0.005（0.3%）。

CKD是全世界增长第二快的导致死亡的病因，同时也是心血管疾病的主要危险因素。研究发现血液透析病人的血清TMAO浓度比正常人高10-20倍。CKD病人血液中TMAO浓度为~30 μmol/L，与血清肌酐和尿素含量正相关。肾透析是肾衰竭病人去除肾毒素的主要方法，透析后血液中TMA和TMAO的浓度会降低，但是仍然比正常人要高。与非透析人不同，透析病人血浆TMAO浓度并不能预测住院和全因死亡率，提示尽管血液中TMAO水平比正常人高好几倍，但是CKD导致的血管内皮损伤程度掩盖了心血管疾病的结果。与透析相似，肾移植成功后，血浆TMAO水平回归正常。CKD通常伴有肠道菌群异常，表现为肠杆菌、卤单胞菌、假单胞菌、莫拉菌和短杆菌丰度升高，乳杆菌和普氏菌降低。这其中的很多细菌与TMA产生相关。尿液中TMA和DMA排泄是肾小球肾病的特征。因为TMAO在肾细胞中作为渗透剂，所以肾脏损伤会导致TMAO水平发生显著改变。例如，在大鼠肾移植 缺血性肾再灌注损伤，肾功能受损导致血浆中TMAO浓度升高3-5倍，而单侧输尿管梗阻性肾间质纤维化与血清中高浓度TMAO相关，发展到后期TMAO水平则相对比较低。尿液中TMAO升高与肾皮质或髓质细胞损伤直接相关，而尿液排泄TMAO过低也可能提示非甾体类抗炎药物如消炎痛引起的肾乳头坏死。

9.4．癌症

癌症是全球人类最重要的死亡病因之一，其病因与遗传和环境因素包括饮食、肥胖、环境污染物、压力和肠道微生物都有关系。有关肠道微生物与癌症风险之间的关系，文献报道的结果基本一致，通常癌症病人尿液TMAO水平降低。比如，乳腺癌和肝细胞肝癌病人的尿液中TMAO水平均降低。移植人胃腺癌的小鼠，其尿液中TMAO浓度在植入后五天明显下降，而TMA水平则升高。抗癌药阿霉素处理可以恢复TMAO和TMA的水平。

血液中TMAO水平与癌症之间的关系取决于癌症类型。低血清TMAO浓度见于鼻咽癌和肾细胞癌患者，肾切除后水平升高。与此相反，血液中TMAO浓度在原发性肝癌、口腔鳞状细胞癌和结直肠癌患者则较高。对于胰腺癌病人，有两项研究发现了相反的结果，一个发现病人血清TMAO降低，另一个则发现其浓度升高。

TMAO和癌症之间关系的机制还不清楚。体外实验表明TMAO可以通过激活TXNIP-NLRP3炎症信号通路来刺激细胞产生活性氧。TMAO也可以通过保护蛋白折叠或者纠正突变蛋白的折叠错误来抑制癌症发生。与上述假设相反，TMAO被发现可以破坏α酪蛋白功能，而α酪蛋白是蛋白伴侣和肿瘤抑制因子，可以帮助对抗乳腺癌。对于胰腺癌、肝癌和结直肠癌，肠道菌群在疾病病理过程中起了重要作用，这三种癌症都引起肠道微生物紊乱。

在脑肿瘤和肾癌中，肿瘤组织内具有高浓度的TMAO和山梨糖醇。特别是胶质脑瘤中，TMA可以作为肿瘤生长的标志物，在高级别肿瘤中TMA浓度比低级别肿瘤高。虽然一些体内NMR研究认为TMA是潜在的癌症生物标志物，但是有时候报道的化学位移看起来更像是TMAO。

当考虑甲胺在癌症中的作用时，甲胺的直接毒性效应不能被忽略。有人提出，膳食中高浓度的胺和酰胺，比如TMAO，可以被转化成TMA和DMA， 而后两者是致癌物二甲基亚硝胺的前体物质。因此，含有高浓度甲胺的海鲜（比如鱿鱼、鲨鱼和鳕鱼等）以及发酵的豆制品所含的DMA和TMA可能在体内形成N-亚硝基化合物。因为富含胆碱和肉碱的食物（比如红肉）可以被代谢成TMAO，所以TMAO与结肠癌相关也并不奇怪。大多数研究得到的证据并不充分，因此系统地研究TMA/TMAO水平与癌症类型和分级的临床诊断之间的关系非常有必要。

10 、结论

演化压力导致TMA和TMAO在多种水生和陆生生物中广泛存在。非生物过程和原核以及真核生物产生的甲胺在生物界无处不在，并发挥重要功能，提示这些简单的化合物参与演化早期基础的化学和生理过程。虽然TMAO直接依赖于细菌产生的TMA，但是二者生物学功能并不相同。TMAO主要功能是蛋白质稳定剂或者破坏剂，而TMA则是一种信号素或者荷尔蒙信号。

最近TMAO已经被归为心脏代谢疾病的不利因素，一些实验表明其是潜在的病因，但是也有一些结果在不同实验中并不一致。将TMAO和TMA完全归为有害分子是不合适的，毫无疑问二者具有重要的生理功能。与很多生化系统类似，分布模式和浓度最终决定了总体的物理效应。TMAO和TMA的代谢起源来于肠道微生物，肠道微生物与人类宿主共同演化，然而大量研究评估TMAO浓度时并没有考虑它的微生物代谢前体TMA。其他现有研究的缺陷是没有考虑饮食对TMAO产生的贡献，并且一些实验在检测前已经将TMA变成TMAO。还有很多常见的有违直觉的现象无法解释，比如为什么日本人饮食中含有大量的TMAO，但是他们心血管疾病的发病率并不高；为什么减肥手术可以降低心血管疾病发生率，但是显著增加TMAO的排泄。

TMAO和TMA在多个不同演化尺度的生物系统中发挥复杂的功能，直觉上告诉我们它们是大多数生命形式所必需的。它们的调控基于广泛而复杂的遗传和环境因素相互作用，表明很有必要在系统水平深入研究TMAO和TMA的化学和生物性质。尽管如此，TMAO/TMA代谢异常与大量人类疾病相关，了解这些过程可能是理解各种疾病病理的基础。