经典重读丨Anal Chem脂蛋白亚类检测新方法
脂蛋白根据密度大小可分为：乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。进一步超速离心，每一种脂蛋白还能分为不同亚类，但是各种亚类相关的功能性研究寥寥无己，这些亚类的定量检测长久以来一直缺乏合适的方法。
2018年10月，英国帝国理工学院的Jeremy K. Nicholson团队在Analytical Chemistry上发表了方法学文章“Quantitative Lipoprotein Subclass and Low Molecular Weight Metabolite Analysis in Human Serum and Plasma by 1 H NMR Spectroscopy in a Multilaboratory Trial”，提出了一种基于NMR的脂蛋白亚类检测方法，可快速定量分析临床血样中105种脂蛋白亚类和24种小分子代谢物，并进行了方法学验证。迄今为止，该方法在多种疾病模型（包括COVID-19）中得到了应用，已被96篇文献进行了引用（截止日期：2022.06.14，数据来源google学术）。
引言
脂蛋白（Lipoprotein）是在血液中运送水不溶性脂类的超分子组装体（球状微粒），由富含胆固醇酯、甘油三酯的疏水性内核和由载脂蛋白、单层磷脂、胆固醇等组成的外壳构成。载脂蛋白是构成脂蛋白的蛋白质组分，主要分A、B、C、D、E五类。基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。主要在肝（部分在小肠）合成，按ABC系统命名，每类又可细分几个亚类，以罗马数字表示。
其中VLDL可分为5个亚类（VLDL 1-5），LDL可分为6个亚类（LDL 1-6），HDL可分为4个亚类（HDL 1-4）。临床上经常使用的血脂检测包括7项：总胆固醇（Cholesterols）、甘油三酯（Triglycerides）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、脂蛋白（a）、载脂蛋白A1（ApoA1）和载脂蛋白B（ApoB），检测原理基于酶促反应，仅需2分钟。但是这样得到的结果并不精准，总胆固醇和HDL是检测得到的，剩下的指标如甘油三酯等都是通过计算得到的。此外，总胆固醇是不同种类脂蛋白上胆固醇的总量，也不区分游离胆固醇和固醇酯，其它指标也存在类似问题。
定量检测脂蛋白的标准方法是使用超速离心机按照密度差异进行物理分离，然而这种方法非常耗时（每个样品要经过两步离心程序约24小时），也仅仅只能获得4或5种主要的脂蛋白（CM，VLDL，LDL，HDL2和HDL3）。每一种脂蛋白的组成各不相同，要想了解其功能，需要对各种亚类进行深入分析。
定量检测脂蛋白的另一种快速方法是使用1H NMR技术。由于脂蛋白这类大分子末端的-CH3和-CH2-会在NMR图谱中形成一系列叠加的宽峰，它们互相之间细微的化学位移差别是由于脂质和颗粒本身大小产生的。而这两类信号峰可以通过线性拟合的方式区分来自VLDL、LDL、HDL和蛋白质的贡献。经过不断的技术发展，我们基于1H NMR的信号去卷积结合多变量统计构建了模型，可以对临床血样中105种脂蛋白亚类和24种小分子代谢物进行定量检测，方法在多中心进行了验证，重复性和准确性极高。
实验过程
来自3个机构的5个实验室参与了本次研究，5个机构分布在四个不同的地理位置，参与实验的共有11台设备，均为Bruker 600 MHz核磁共振波谱仪，均使用IVDr方法对样品进行检测。
标准物质来自NIST的1951c（冷冻人血清中的脂类标准物质）。
中心QC样本来自37名健康志愿者（男19人，女18个），所有血样先混合再等分20份/每中心，冻融次数一致，用于10天检测期内的质量控制。
脂蛋白亚类检测方法建立
使用Bruker商业化的IVDr方法（B.I.-LISA），先将基于PULCON方法的核磁谱图归一化为质子浓度为mmol/L，再对数据进行均值中心化，化学位移较正使用TSP的甲基信号和丙氨酸双峰的1.48 ppm信号。对化学位移为0.8 ppm（-CH3）和1.25 ppm（-CH2）的信号分别使用PLS-2回归模型（使用两个百人队列建立）进行拟合，得到105种脂蛋白亚类浓度。
代谢物小分子检测方法建立
使用内部开发的基于图形的Matlab算法实现，一维1H谱图即可定量。
实验结果
脂蛋白亚类方法精密度
1951c的甘油三酯、总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇的浓度已知，将IVDr方法检测得到的结果与之比较，两者的相关度均高于0.90。检测相对误差低于13%，符合NECP的要求。
室内室间重现性
方法具有极佳的重现性和精密度，均符合NECP的要求。
总结
临床血清或血浆的脂蛋白亚类定量分析对于了解许多疾病（诸如心血管疾病、代谢综合征、神经病理学和其它以脂质谢紊乱为特征的疾病）的发病机制是必要而重要的。我们评估了一种同时检测血样中105种脂蛋白亚类、12种比值和24种小分子代谢物的方法，结果可在11台核磁共振波谱仪上得到重现，总误差范围在3.4%~10.5%之间（NCEP可接受的范围是8.9%~15%），准确度极高，方法重现性也满足相应要求。这些数据表明，只要按照标准操作程序进行检测，不同实验室的结果的可靠性均能得到保证。
