重磅综述丨Phenomics阿尔茨海默症进展
《表型组学》（Phenomics）以封面论文在线发表了美国威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组题为Recent Advances in Understanding of Alzheimer’s Disease Progression Through Mass Spectrometry-Based Metabolomics的综述文章。论文DOI链接：https://doi.org/10.1007/s43657-021-00036-9。
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）是老年人群出现痴呆的主要原因，它给国家和社会经济带来的负担越来越重。因此，阿尔茨海默症早期诊断尤为重要，其最大挑战在于在更严重的、不可逆的症状出现之前诊断出处于临床前阶段的个体。
筛选生物标志物对于准确诊断阿尔茨海默症患者至关重要。一个可靠的生物标志物必须显示出可测量的变化，协助区分健康人和患者。当然，最好能在疾病进展的轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）阶段就区分出健康人与阿尔茨海默症患者。传统的生物标志物发现通常来源于蛋白质（蛋白质组学）或基因（基因组学）研究，而代谢组研究可以揭示患者表型，包括遗传因素和环境影响。由于代谢组学可以测量特定时间存在的代谢物，故能揭示患者随时间变化的生理状态及其对特定刺激的动态反应。
很显然，患者的脑组织不是生物标志物筛选的可行样本来源；因此，早期研究使用死后的脑组织作为阿尔茨海默症生物标志物来源；现在，研究者们开始转向关注循环体液中的潜在样本对象。质谱（MS）是一种强大的、无标签的技术，可用于代谢物的鉴定和定量。该篇综述讨论了基于质谱（MS）的阿尔茨海默症代谢组学研究，包括样品类型和制备、质谱数据采集策略和数据分析以及从研究中获得的生物学见解，希望为未来的阿尔茨海默症代谢组学研究提供参考。
实验设计
患者筛选
患者招募和选择对任何疾病的研究都是至关重要的，但由于阿尔茨海默症在患者死后才能明确诊断，因此，阿尔茨海默症研究的患者选择存在不确定性。在该综述中，所提及的多项研究所采用的阿尔茨海默症诊断标准各不相同，例如美国国家老龄化研究所-阿尔茨海默氏症协会（NIA-AA）的标准、美国国家神经和交际障碍疾病及中风研究所和阿尔茨海默氏症及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）颁发的标准以及《精神疾病诊断与统计手册》第四版（DSM-IV）所采用的不同标准等。
其中，NIA-AA标准承认使用生物标志物作为诊断手段的潜力，该标准认可的阿尔茨海默症诊断生物标志物包括成像和生化生物标志物，可分为三类：聚集的β-淀粉样蛋白（Aβ）、聚集的tau（神经纤维缠结）以及神经退行/神经元损伤（表1）。
样本类型
阿尔茨海默症生物标志物的代谢组学研究可以选择多种不同类型的样本。脑脊液（Cerebrospinal Fluid，CSF）是最广泛使用的体液之一，但收集CSF是一个侵入性的过程且必须由医生来完成，这使得难以将该体液用于大规模筛选。
此外，血浆也是阿尔茨海默症研究的样本来源之一。相对CSF采集，血浆获取更便捷，且能相对准确地代表整个身体系统。然而，由于血脑屏障的存在，血液代谢情况可能难以反映大脑的代谢情况。此外，一些研究表明，血浆代谢情况会因性别、年龄和种族等因素而异。目前，诸多研究将血浆与其他类型样本结合使用（图2）。血清和血浆密切相关，血清的整体代谢物浓度较高，但在不同样本间的定量和重现性相比血浆较差。
尿液因其具有非侵入性、无菌且易收集的特点，也可作为生物标志物的来源。但尿液主要含有亲水性代谢物，其脂类和其他非极性代谢物的浓度较低；而脂质代谢失调却是阿尔茨海默症研究关注内容之一，因而尿液可能不是阿尔茨海默症生物标志物的合适来源样本。
唾液是最容易获得的体液之一。但阿尔茨海默症经常导致患者唾液流量减少和口干，这使得很难收集到足够的样本进行分析。
样本收集与准备
代谢组的样本收集与准备主要分为三个部分：空腹采样、萃取和衍生化。
空腹采血是多种血液测试的标准做法，因为消化过程可能会提高某些代谢物和营养物质的水平，如葡萄糖和甘油三酯。也有研究却表明，空腹时一些代谢物的浓度与非空腹时的浓度没有显著差别。该综述中有9项研究要求受试者在样本采集前禁食，2项不要求禁食（样本为血浆），另有4项没有说明。
萃取溶剂的选择决定了哪些代谢物将被提取出来从而进行分析。理想溶剂可以提取到所有的代谢物并将其降解到最小分子质量。萃取一般可以分为两类：单相萃取和双相萃取。单相萃取法使用单一溶剂将代谢物萃取到一个相中，操作简单，有很大优势。该综述包括了9项利用单相萃取的研究，其中7项使用了乙腈。此外，甲醇也常被用作单相萃取溶剂。双相萃取法则利用溶剂组合将代谢物萃取到极性或非极性相中，溶剂组合通常为水加一种有机溶剂。双相萃取可以获得更高的代谢组覆盖度，且双相溶剂组合可利用互补分离的方法进行代谢组研究。因此，双相萃取法属于国际代谢组研究中最常用的方法。当然，双相萃取也有一些缺点，即在处理许多双相溶剂组合时，耗时长且技术难度大。
分析物的化学衍生化对于进一步检测至关重要，通过衍生化可以改变代谢物的结构、分子极性和大小。衍生化也可以用来稳定待分析物分子，一般来说，气相色谱法（GC-MS）需要衍生化来增加待分析物的热/化学稳定性和挥发性。GC-MS中的衍生化也可以通过改变待分析物的分子特性（如极性）来提高分离效果。常用的衍生化包括硅烷化、肟化、烷基化和酰基化。该综述中的大多数研究使用了无标签的方法，但实际上，同位素标签已被广泛应用在标记官能团、定量代谢物等方面。
质谱数据的采集
质谱数据采集的过程主要包括分子分离、电离、质量分析。
该篇综述中介绍了多种分离方法，包括反相液相色谱（RPLC）、亲水作用色谱（HILIC）、LC-MS、GC-MS等。其中，RPLC能够覆盖人类代谢组的非极性和半极性部分，但极性代谢物在C18柱上的保留率很低，并且会因洗脱太快而无法分离和检测。HILIC根据分子的亲水性进行分离，疏水性的代谢物会较早被洗脱，而亲水性的、典型的极性代谢物被很好地保留。HILIC是对RPLC的补充，经常被正交使用，以确保在非靶向实验中完全覆盖阿尔茨海默症代谢组（图3）。
LC-MS、GC-MS也常被用在代谢组实验中，但不是所有的代谢物都能被挥发或热稳定到足以用于GC-MS。此外，毛细管电泳（CE）是一种极具成本效益的分离方法，它需要的样品量很小，并且最适用于极性和带电代谢物的分离，这使其成为RPLC的补充方法。离子迁移光谱-质谱（IMS-MS）也是一种独特的分离和识别代谢物的方法。上述所有的分离技术都是在电离前分离代谢物，而IMS-MS则是利用缓冲气体来分离电离后的分子。
电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）因能广泛覆盖分子而成为代谢组学的首选技术。ESI在正极性（ESI+）和负极性（ESI-）模式下操作：容易被质子化的分子（碱）在ESI+中更容易被检测到，而可以去质子化的分子（酸）在ESI-中更容易被检测到。
代谢组的研究可分为靶向或非靶向两大类，靶向的目的是对已经确定分析物的特定代谢物进行定量，而非靶向代谢组研究寻求更大的代谢组覆盖率，并旨在通过高分辨率来区分具有相似质量的分子。为了在质量分辨率较低的情况下增加代谢物鉴定的可靠性，可以使用串联质谱（MS/MS）。该综述中涉及的大多数研究都采用MS/MS进行实验。
数据分析和生物信息学方法
靶向代谢组学研究通常有一个较小的分析物范围，这使得加入内参便能实现绝对定量。该综述中包括的一些研究利用稳定的同位素标准进行绝对定量，但大多数研究使用有质控的相对定量和变化倍数计算。在靶向研究中针对大规模代谢物进行量化的前景十分明朗，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）和平行反应监测（parallel reaction monitoring，PRM）等技术正力图提供实现大规模靶向代谢组学量化的途径。
数据预处理是代谢组学研究中的一个重要步骤，包括去卷积和特征检测等步骤，还包括空白校正和归一化等质量控制步骤。尽管存在一些商业软件包，如Compound Discoverer™和MetaboScape®，但这些仅适用于特定质谱仪器的数据分析。目前逐渐流行的是将原始数据文件转换为与开源软件包（如MS-DIAL、XCMS）兼容的开放格式。
在该综述提及的研究中，根据其统计分析思路可分为两类：将代谢物浓度与公认的生物标志物（如Aβ）相关联，以及将代谢物浓度与是否存在阿尔茨海默症痴呆症状相关联。前者可能更有利于检测到重要生物标志物，因为代谢物浓度的变化可能更容易与淀粉样蛋白聚集物的增加而不是感知到的认知变化等相关（图4）。
生物学见解
该综述包括了15项不同的阿尔茨海默症代谢组学研究，并且各自都使用了不同的体液样本。通过比较从各种分离方法及质谱技术中所得到的发现，可以确定研究结果的一致性如何。通过多种体液之间的比较，不仅可以显示出多个系统之间的相似性，还可以阐明不同体液之间的关系。该综述整合讨论了这些研究数据，并对几个重要的代谢途径进行了详细分析。
能量代谢
研究发现在一些体液中能够检测到与能量有关的代谢物。该文总结了一些相关的关键特征：阿尔茨海默症患者的大脑通常显示出葡萄糖代谢水平明显下降；阿尔茨海默症患者的能量代谢失调还表现为胰岛素抵抗和大脑中胰岛素的低表达；山梨醇浓度的增加表明葡萄糖-山梨醇途径在阿尔茨海默症患者中可能被激活；3-羟基丁酸在阿尔茨海默症患者尿液中持续减少等等。
氨基酸代谢
阿尔茨海默症患者体内，精氨酸在CSF和血浆中表达量减少，提示由于精氨酸酶和一氧化氮（NO）合成酶之间的相互作用，使得精氨酸酶的表达可能有所增加。一氧化氮是维持大脑功能的关键，可调节脑血流，并作为一种神经递质发挥作用。如果没有精氨酸酶表达量的变化，精氨酸的减少也可归因于精氨酸转向代谢为胍基化合物。已知的许多胍基化合物具有神经毒性，从而会增加氧化应激反应。
异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸是被称为支链氨基酸（branched chain amino acids , BCAA）的三种必需氨基酸。该综述所提及的研究中，与对照组相比，阿尔茨海默症患者体内三种BCAAs表达量均有所下降。体内BCAAs浓度的降低可能导致谷氨酸的产生减少，导致大脑中谷氨酸能神经元的损失。缬氨酸在枫糖尿病患者体内的高浓度与细胞凋亡的增加有关。缬氨酸浓度降低可能是阿尔茨海默症患者的身体对体内细胞凋亡进程增加所作出的反应。
此外，血液中同型半胱氨酸的异常积累也与阿尔茨海默症发展的高风险有关。高同型半胱氨酸水平与区域性脑萎缩和血管病变有关，可能影响tau蛋白的磷酸化和胆碱酯酶的降解。
胆碱代谢
阿尔茨海默症早期发展的病理事件包括基底前脑的胆碱能神经元损失。乙酰胆碱是一种能够参与胆碱能神经元系统（包括运动神经元和参与记忆的神经元）活动的基本神经递质。
乙酰胆碱是由胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）产生的，这种酶在阿尔茨海默症患者大脑中的活性明显降低，其活性降低程度与认知障碍的严重程度相关。多项研究检测发现阿尔茨海默症患者的胆碱浓度增加，这可能是由于ChAT的活性下降引起的。尽管目前尚无可逆转阿尔茨海默症发展的药物治疗手段，胆碱酯酶抑制剂通常被用于暂时改善阿尔茨海默症患者的一些认知症状。
脂肪酸代谢
相关研究检测到几个与肉碱有关的代谢物出现了明显的改变，表明阿尔茨海默症患者的脂肪酸代谢发生紊乱。中链酰基肉碱在阿尔茨海默症患者血浆中明显减少，并与衡量认知表现的小型精神状态检查（mini-mental state examination, MMSE）得分有高度相关性。此外，研究发现阿尔茨海默症患者血浆中花生四烯酸的减少及其前体亚油酸的增加。亚油酸和花生四烯酸都被证明可以诱导tau和Aβ的聚合，这意味着它们可能关联并甚至诱发了阿尔茨海默症的一些病理变化。
总结与展望
阿尔茨海默症是一种非常复杂的疾病，绝非仅由一种代谢功能紊乱所导致，本综述中的研究阐述了阿尔茨海默症的相关代谢紊乱，后续逐渐统一的阿尔茨海默症相关研究将有利于探寻更加明确的受影响通路。
阿尔茨海默症研究应建立更加统一的患者队列标准，并增加患者队列的多样性。此外，阿尔茨海默症研究设计的一致性也应该扩展到相关的实验方法中。对于潜在的阿尔茨海默症生物标志物而言，它需要持续失调并不断地出现在阿尔茨海默症代谢研究中。
文中讨论的每种样本类型都具有优势和劣势，而通过唾液和尿液的非侵入式的样本收集对基于生物标志物的阿尔茨海默症诊断需谨慎考虑。尽管收集尿液或唾液可以减缓对患者的创伤，且具有很强的便利性，但因阿尔茨海默症患者经常出现神经精神性症状和精神病性症状，应用上述两种方法仍需十分谨慎。尽管如此，任何可从患者轻松收集到的样本都将大大减少患者和护理人员的压力。
随着更多研究的深入开展，可以配合使用许多潜在的代谢生物标志物和与目前公认的蛋白质生物标志物相结合，以便在疾病的早期阶段更加准确地诊断阿尔茨海默症。
Abstract
Alzheimer’s disease (AD) is the leading cause of dementia in the aging population, but despite extensive research, there is no consensus on the biological cause of AD. While AD research is dominated by protein/peptide-centric research based on the amyloid hypothesis, a theory that designates dysfunction in beta-amyloid production, accumulation, or disposal as the primary cause of AD, many studies focus on metabolomics as a means of understanding the biological processes behind AD progression. In this review, we discuss mass spectrometry (MS)-based AD metabolomics studies, including sample type and preparation, mass spectrometry data acquisition strategies, and data analysis, as well as biological insights gleaned from these studies, with the hope of informing future AD metabolomic studies.
作者简介
Lingjun Li（李灵军）教授，2002年加入美国威斯康星大学麦迪逊分校，致力于生物分析科学以及质谱相关技术的研究，主要涉及的领域有神经肽组学、蛋白质组学、代谢组学等，并应用这些尖端的分析方法和技术去解决神经生物学、基础和临床医学中的关键性问题。
文章转自微信公众号人类表型组计划。
