多组学联合分析，拿下CNS牛刊不是梦
以下文章转载于果壳生物，原作者Jay
微生物群（Microbiota）是指特定时间及特定生境中所有微生物有机体的总称，包括非细胞结构的病毒、原核生物中的细菌和古菌及真核细胞微生物。微生物组（Microbiome）是指特定时间及特定生境中微生物群所包含的基因序列（含同源序列总和）。近年来，针对环境微生物的研究，逐渐成为各个领域的研究热点。目前基于环境微生物的测序策略主要包括微生物多样性、宏基因组及宏转录组等多个产品。其中应用最广泛的是微生物多样性，目前在人体肠道菌群、皮肤、口腔、阴道、土壤、水体、空气及发酵等研究领域被广泛应用。
环境样本中的微生物
近年来，基于微生物多样性测序技术发表的文章呈现逐年攀升的趋势，据不完全统计，2019年，仅细菌多样性发表文章数量约达2700篇，截止2020年7月已经发表约1600篇。但是随着测序技术的不断完善和科研水平的日益提升，单一组学很难满足科研需求，利用多组学联合分析的手段解决科学问题已然是大势所趋。小编基于文献调研和多年的项目经验，总结了关于微生物多样性测序技术多组学文章的研究思路及其案例，希望对各位老师的科学研究有所帮助。
数据来源于NCBI，搜索关键词“16S + diversity”
微生物多样性
微生物多样性测序技术是研究环境样本中微生物的物种种类和丰度。
基于单独的微生物多样性测序数据发表的文章思路比较简单，首先通过物种分布柱状图和α多样性对环境样本中物种的组成进行初步的分析。然后通过β多样性宏观分析不同样本/组间是否存在差异，如果存在差异，通过Metastats和LEfSe分析找出导致不同样本/组间微生物群落结构差异的关建菌，找到了关建菌之后就可以结合研究背景进行深入探讨，也可以通过功能基因预测揭示在环境样本中关键菌可能发挥着的功能和参与的代谢途径等，从而来揭示科学问题。此外，可以结合生理生化指标进行RDA/CCA分析，从而明确生理生化指标和特定物种及样本间的相关性。
微生物多样性主要分析结果
微生物多样性案例解析
Microbiome：农业管理和植物选择相互作用影响根际微生物群落结构和氮循环
Agricultural management and plant selection interactively affect rhizosphere microbial community structure and nitrogen cycling，2019，Microbiome，DOI:10.1186/s40168-019-0756-9.
根际微生物群落是由农业管理和宿主选择过程之间的相互作用形成的。本研究基于QIIME2分析流程探讨农业管理(M)和根际效应(R)对长期常规管理和有机管理的玉米-番茄轮作农业生态系统中玉米根部微生物群落结构和共生网络影响，揭示这些因素之间的相互作用及其影响根际微生物类群、共生网络结构和微生物氮循环的过程。本研究对土壤样本进行16S V4和ITS1多样性测序，ASV分析结果显示细菌和古菌多样性受管理系统和土壤生态位的影响，真菌群落结构组成仅受管理影响，网络结构仅受植物选择影响。对氮循环功能基因进行qPCR，定量结果表明只有nosZ基因丰度受管理的影响，且在有机系统中丰度更高。
文章主要分析结果
微生物多样性+宏基因组学
微生物多样性，快速且经济，由于PCR过程导致了偏好性，可能降低了注释准确度。原核、真核生物的“分类标签”完全不同，即使细菌和古菌的16S也有很大差异，病毒更难捕获，且只能初步预测功能结构信息。宏基因组有效避免了扩增偏差，环境样本中Total DNA被直接打断，物种注释更全面（细菌、真菌、古菌及真核生物等），此外，还可能组装获得新基因乃至新物种信息，主要侧重于群落的功能结构研究。那么如何更高效、准确的了解微生物物种组成、多样性、功能组成及丰度情况呢？采用16S和宏基因组联合分析已经成为高分文章的主流思路。首先基于16S进行大样本测序分析，宏观筛选出不同条件样本间物种种类和丰度差异比较大或者比较有代表性的样本，进行宏基因组测序，不仅可以验证16S的分析结论的准确性，还可以更加深入挖掘功能基因和代谢通路等，以此阐明群落的功能情况，更好的说明微生物群落与环境之间的关系。
微生物多样性+宏基因组学研究思路
微生物多样性+代谢组学
近年来，随着微生物组学研究的不断发展，很多界内大佬纷纷开始将微生物组学和代谢组学联合起来，以期从物种、基因以及代谢产物等水平共同解释科学问题，广泛应用在医学疾病肿瘤、中医中药、食品科学及畜牧水产等研究领域。微生物多样性测序技术可以解决"who is there"（那有谁），宏基因组测序技术可以解决 "what are they doing"（在干嘛）的问题。而代谢组学是研究生物体中代谢产物变化的科学，常用研究方法包括了：LC/MS（液质联用），GC/MS（气质联用）和NMR（核磁共振），可以解决"what have really happened"的问题。目前基于微生物多样性+代谢组学关联分析的研究思路，可参考下文案例。
微生物多样性+代谢组学研究思路
微生物多样性+代谢组学案例解析
Nature 子刊：人群队列的肠道菌群和血液代谢物的关系
Relationship between gut microbiota and circulating metabolites in population-based cohorts，2019，Nature Communications，DOI: 10.1038/s41467-019-13721-1.
目前，很多研究报道揭示肠道菌群主要通过微生物的代谢和免疫信号进入循环系统，进而影响着人类的健康。研究表明肥胖、糖尿病、心血管疾病与肠道微生物密切关联，微生物是循环血脂水平主要的驱动者。本研究主要基于Rotterdam（n = 1390，平均年龄56.9±5.9，女性57.5％）和 LifeLines-DEEP（n = 915，平均年龄44 ± 13.9，女性的58.7％）两队列的志愿者，进行粪便样本16S V4细菌多样性测序和血液样本代谢物的检测（NMR）。通过线性回归分析评估肠道菌群与代谢物之间的关系，同时校正了年龄、性别、BMI、技术协变量、药物使用及多项检测。该研究结果找到了32个微生物科/属与极低密度和高密度亚组分、血脂测定、糖酵解相关代谢物、酮体、氨基酸及急性反应标记物，为了解微生物群在宿主代谢中的作用提供理论依据。
校正了多种验证，年龄，性别，体重指数，技术协变量，用药后等，循环代谢物与肠道菌群之间的关联分析
微生物多样性+宏基因组学+代谢组学
人体与其共生的微生物组成了整个庞大而缜密的“个体”，与人体共生的微生物个数约100W亿，而肠道菌群占据主要的人体微生物的组成，肠道微生物包括有益菌和有害菌，时刻影响着人体大脑的功能、情绪和行为。这些错综复杂且相互关联的沟通交流途径构成了我们所熟知的“肠脑轴”（MGB）。2019年，发表在《Physiol Review》杂志上题目为《The microbiota-gut-brain axis》的文章研究结果表明，肠道微生物通过肠-脑轴调控脑功能和行为。无菌动物、抗生素、粪菌移植、脑成像、测序和生物信息学等是主要研究手段。菌群-肠-脑轴在不同年龄阶段呈现不同的微生物群落结构，肠道菌群与脑通过自主神经、肠神经、免疫系统、肠内分泌信号、神经递质、支链氨基酸、胆汁酸、短链脂肪酸、脊髓、下丘脑-垂体-肾上腺轴、肽聚糖等途径和介质进行双向交流。环境、饮食、遗传、压力等因素影响菌群-肠-脑轴，菌群参与多种神经相关疾病。近年来，疾病与菌群-肠-脑轴（MGB）方向的研究逐渐火热，在顶尖杂志上的报道均取得突破性进展。
文章主要分析结果
微生物多样性+宏基因组学+代谢组学案例解析
Science 子刊：精神分裂症患者潜在的菌群-肠-脑轴作用机制
The gut microbiome from patients with schizophrenia modulates the glutamate-glutamine-GABA cycle and schizophrenia-relevant behaviors in mice，2019，Science Advances，IF 11.511
肠道微生物可以通过菌群-肠-脑轴（MGB）调节脑功能和行为。研究表明，MGB的紊乱可能与 SCZ（精神分裂症）的发生有关。为解析肠脑轴的发育是否与精神分裂症有关，本研究首先基于健康人群（HCs）和精神分裂症患者（SCZ）粪便样本进行16S V3+V4细菌多样性测序。发现SCZ与HCs相比，有明显失调的肠道微生物，由Aerococcaceae、Bifidobacteriaceae、Brucellaceae、Pasteurellaceae和Rikenellaceae 组成的特定的微生物团体可以作为区分SCZ 和 HCs（AUC=0.769）的biomarker。其次，将SCZ和HCs的粪便移植到无菌小鼠体内验证其肠道微生物功能，对移植两周后的小鼠粪便进行宏基因组测序，发现与Control FTM小鼠相比，SCZ的FTM小鼠富集脂质和氨基酸代谢的基因会更多。同时，对小鼠粪便、血清和海马体进行非靶向代谢组学检测，发现与移植 HC 粪菌的小鼠相比，移植 SCZ 粪菌小鼠的海马区的谷氨酸盐显著降低，谷氨酰胺和 GABA 显著增加。结果表明，SCZ 的肠道菌群可以通过与 SCZ 病理相关的方式改变神经化学和神经功能。
文章研究思路
文章研究思路流程图
